Kloning gen penyandi protein mikronema 3 (MIC3) Takizoit Toxoplasma gondii isolat lokal

DEWI, Ni Nyoman Ayu, Dr.drh. Wayan T. Artama

2006 | Tesis | S2 Bioteknologi

Protein mikronema 3 (MIC3) takizoit Toxoplasma gondii merupakan salah satu protein yang berperan penting pada proses invasi parasit ini ke sel hospes. Gen penyandi protein MIC3 telah diteliti dan merupakan kandidat vaksin baru yang potensial dalam mengatasi toksoplasmosis. Penelitian yang dilakukan bertujuan memperoleh klon yang membawa gen penyandi protein MIC3 takizoit melalui teknik DNA rekombinan dengan melakukan kloning hasil amplifikasi DNA menggunakan primer spesifik. Kultivasi takizoit Toxoplasma gondii dilakukan secara in vivo pada mencit strain Balb/C. Isolasi DNA dilakukan setelah beberapa kali pasase dan diperoleh jumlah takizoit yang cukup (minimal 1x108 takizoit/ml) dan selanjutnya DNA diamplifikasi menggunakan PuRe Taq RTG-PCR Beads (Amersham Bioscience) dengan primer spesifik (Cybergene AB) dan produknya diligasi pada pGEM-T (Promega). Plasmid rekombinan ditranformasi ke dalam Escherichia coli XL-1 Blue dengan teknik heat shock dan transforman ditanam pada plate agar LB yang mengandung ampisilin, X-gal, dan IPTG. Koloni putih yang menunjukkan koloni rekombinan ditumbuhkan dalam media LB yang telah ditambahkan ampisilin pada suhu 37oC semalam. Plasmid DNA rekombinan diisolasi dengan metode lisis alkali dan dielektroforesis pada gel agarose 1% (SeaKem). Analisa plasmid rekombinan dilakukan dengan cara didigesti menggunakan enzim restriksi endonuklease PstI, HindIII, NcoI dan EcoRV dan selanjutnya disekuensing untuk memastikan urutan basanya (ABIPRISM 377 DNA Sequencer). Hasil penelitian menunjukkan bahwa transformasi pada Escherichia coli XL-1 Blue dengan menggunakan vektor pGEM-T diperoleh klon yang membawa gen penyandi protein MIC3 isolat lokal sebesar 1,2 kb. Sekuensing DNA rekombinan 489 bp dari ujung 5’ dan 447 bp dari ujung 3’ menunjukkan homologi dengan gen penyandi protein MIC3 Toxoplasma gondii isolat RH sebesar 97-98%.

Microneme 3 (MIC3) protein tachyzoite Toxoplasma gondii is one of proteins which play an important role during cell host invasion. Gene encoding MIC3 protein has been studied and it was suggested a potent vaccine candidate against Toxoplasma gondii infection. The aim of this study is to clone the gene encoding MIC3 protein of tachyzoite Toxoplasma gondii local isolate by amplification using polymerase chain reaction with specific primers. DNA isolation was done after in vivo cultivation of tachyzoites in Balb/C mice and then the target gene was amplified using PuRe Taq RTG-PCR Beads (Amersham Bioscience), specific primers (Cybergene AB), with positive control (RH isolate) and negative control (without template). The amplified DNA fragment was cloned into pGEM-T (Promega) and transformed into E. coli XL-1 Blue by heat shock method, then plated on LB agar containing ampicillin, X-gal and IPTG. White colonies (recombinant colonies) were picked up and put in LB medium and incubated at 37oC for overnight. Recombinant plasmids were isolated using alkali lysis method and run on a 1% agarose gel (SeaKem). Analysis of recombinant plasmids were done by digestion using restriction endonuclease PstI, HindIII, NcoI and EcoRV and then the recombinant plasmids were sequenced to find out the nucleotide sequence of insert gene (ABIPRISM 377 DNA Sequencer). The computer software was used to analyze the DNA sequence for alignment. The result showed that transformation in E.coli XL-1 Blue by pGEM-T produced a clone that was encoding MIC3 protein. Analysis of 489 bp from 5’ and 447 bp from 3’ of gene sequence showed 97-98% homolog with gene encoding MIC3 protein RH isolate.

Kata Kunci : Kloning MIC3,Toxoplasma Gondii, MIC3 protein, Toxoplasma gondii, tachyzoite, recombinant DNA