Isolasi, purifikasi, dan karakterisasi Beta-1,3-Glukanase Trichoderma reesei serta uji aktivitasnya pada fungi akar Ganoderma philippii

BUDIARTI, Sri Wahyuni, Prof.Dr. S.M. Widyastuti, M.Sc

2006 | Tesis | S2 Bioteknologi

Enzim litik yang dihasilkan beberapa spesies fungi mikoparasit Trichoderma berperan penting dalam menghambat pertumbuhan fungi akar G. philippii. Meskipun demikian, mekanisme mikoparasitisme Trichoderma terutama yang melibatkan enzim-enzim pendegradasi dinding sel sampai saat ini belum dijelaskan secara tuntas. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan isolasi, purifikasi, dan karakterisasi ß-1,3-glukanase yang dihasilkan oleh T. reesei, serta mengetahui aktivitas ß-1,3-glukanase tersebut terhadap fungi akar G. philppii Penelitian diawali dengan kegiatan memproduksi enzim ekstraseluler ß-1,3-glukanase yang dihasilkan dengan menumbuhkan fungi mikoparasit T. reesei isolat T13 pada kitin dan sukrosa sebagai sumber karbon. Isolasi ß-1,3- glukanase dilakukan melalui tahapan pengendapan amonium sulfat yang digunakan untuk memurnikan enzim, dilanjutkan dengan kromatografi gel filtrasi dan kromatofokusing. SDS-PAGE 12% digunakan untuk mengetahui tingkat kemurnian enzim pada tiap tahap pemurnian. ß-1,3-glukanase yang diperoleh dikarakterisasi berat molekulnya, pH optimal aktivitas enzim, suhu optimal aktivitas enzim. Uji aktivitas antifungal dilakukan dengan menggunakan modifikasi metode cup plate. Hasil penelitian menunjukkan tiga isofom ß-1,3-glukanase, yaitu ß-1,3- glukanase-I, ß-1,3-glukanase-II, dan ß-1,3-glukanase -III mempunyai berat molekul secara beturut-turut 90 kDa, 75 kDa, dan 64 kDa, dan masing-masing memiliki pH optimal 5 dan suhu optimal 50 oC. Uji antifungal ß-1,3-glukanase terhadap miselia G. philippii mengindikasikan bahwa tidak terjadi penghambatan pertumbuhan G. philippii pada uji in vitro. Pengamatan secara mikroskopis menunjukkan bahwa aplikasi ß-1,3-glukanase mampu menyebabkan terjadinya nekrosis terhadap hifa G. philippii, sedangkan kombinasi ß-1,3-glukanase dan kitinase T. harzianum (Sigma) menunjukkan adanya lisis pada hifa G. philippii.

The enzymes from Trichoderma species that inhibite fungal cell walls have been suggested to play an important role in mycoparasitic action against fungal root rot pathogen G. philippii. Although the mechanism of mycoparasitism is not fully understood, expression of extracellular cell-wall degrading enzymes is assumed to be involved in this process. This experiment was aimed to purify and characterize the ß-1,3-glucanase of T. reesei, and determined the ß-1,3-glucanase activity of T. reesei against root rot pathogen G. philippii. Extracellular ß-1,3-glucanase was produced by growing mycoparasite T. reesei strain T13 in colloidal chitin and sucrose as carbon sources. The enzyme was then purified to its homogeneity by precipitation with ammonium sulfate, followed by gel filtration chromatography and chromatofocusing. SDS-PAGE 12% was used to confirm the purity of enzyme at each stage of preparation and to characterize purified protein. Fungal bioassay was done using modified cup plate methods. The results showed that T. reesei produced at least three extracellular ß-1,3-glucanases. Estimation of molecular weight based on SDS-PAGE 12% have three isoform of ß-1,3-glucanase were 90 kDa for ß-1,3-glucanase-I, 75 kDa for ß-1,3-glucanase -II, and 64 kDa for ß-1,3-glucanase-III. Their optimum pH dan tempera ture were 5 dan 50 oC, respectively. Result of bioassay test of ß-1,3- glucanase activity in vitro unable to form growth inhibition against the mycelia of G. philippii. Microscopic observation revealed that the enzyme caused necrotic lesion, whereas the combination of ß-1,3-glucanase and chitinase from T. harzianum (Sigma) caused lyzed the hyphae of G. philippii.

Kata Kunci : Beta,1,3,Glukanase,Uji Aktivitas Antifungi,Ganoderma Philippii,ß-1,3-glucanase, antifungal activity, Trichoderma reesei, Ganoderma philippii