Optimasi Metode Preparasi Sampel untuk Identifikasi Protein dan Metabolit Kacang Kedelai (Glycine max) menggunakan LC-MS/MS

Kevin Lensrich, Dr.rer.nat. apt. Siti Nurul Hidayah, M.Sc.

2026 | Skripsi | FARMASI

Kacang kedelai (Glycine max) memiliki potensi sebagai bahan aktif kosmeseutikal karena kandungan protein dan metabolit seperti isoflavon yang tinggi. Namun, kompleksitas matriks seluler kacang kedelai menjadi tantangan dalam proses karakterisasi senyawa aktif kacang kedelai dengan instrumen LC-MS/MS. Oleh karena itu, preparasi sampel menjadi tahapan yang sangat penting untuk mengurangi kompleksitas sampel sebelum masuk ke LC-MS/MS. Penelitian ini bertujuan mengoptimasi metode preparasi sampel untuk analisis protein dan metabolit kacang kedelai menggunakan LC-MS/MS.

Pada analisis protein, dibandingkan empat tahap preparasi sampel, yaitu defatting, ekstraksi dengan dapar fosfat, presipitasi asetonitril, dan presipitasi aseton terhadap pita protein SDS-PAGE untuk mengetahui tahapan preparasi sampel yang optimal. Setelah itu, dilakukan identifikasi protein dengan RPLC-Q-Orbitrap menggunakan variasi database reviewed dan one protein sequence per gene. Pada analisis metabolit, dibandingkan perlakuan pelarut air dan metanol terhadap kualitas Total Ion Chromatogram (TIC) pada rentang m/z 50–1.000 dan jenis metabolit yang teridentifikasi menggunakan RPLC-Q-ToF. Selain itu, dilakukan evaluasi terhadap metode LC-MS/MS rutin yang digunakan untuk analisis proteomik dan metabolomik.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa preparasi kacang kedelai hingga tahap ekstraksi dengan dapar fosfat merupakan metode yang optimal dilihat dari profil pita protein SDS-PAGE yang lengkap dengan preparasi yang minimal. Selanjutnya, penggunaan database one protein sequence per gene meningkatkan jumlah protein teridentifikasi, yaitu sebanyak 56 kelompok protein dibandingkan database reviewed yang hanya mengidentifikasi empat protein. Pada analisis metabolit, berdasarkan TIC, metanol merupakan pelarut yang lebih optimal dibandingkan air karena menghasilkan baseline TIC yang lebih rendah. Namun, berdasarkan metabolit yang teridentifikasi, baik pelarut air maupun metanol memiliki selektivitas yang berbeda terhadap metabolit yang teridentifikasi, sehingga keduanya dapat digunakan secara komplementer untuk memperoleh identitas metabolit yang lebih komprehensif. Evaluasi TIC pada metode rutin LC-MS/MS untuk analisis protein dan metabolit menunjukkan adanya penumpukan puncak hidrofobik pada fase pencucian kolom, sehingga direkomendasikan penggunaan gradien yang lebih landai untuk kedua metode tersebut guna meningkatkan kapasitas pemisahan.

Soybean (Glycine max) seed is considered as potential cosmeceutical active ingredient due to its abundance of proteins and metabolites such as isoflavones. However, the complexity of the soybean seeds cellular matrix poses a significant challenge in the characterization of its bioactive components using LC-MS/MS. Therefore, sample preparation is a critical step to reduce sample complexity prior to LC-MS/MS analysis. This study optimizes sample preparation methods for the LC-MS/MS analysis of soybean seed proteins and metabolites.

For protein analysis, four sample preparation steps were compared, namely defatting, phosphate buffer extraction, acetonitrile precipitation, and acetone precipitation, based on SDS-PAGE protein bands to determine the most optimal preparation stage. Protein identification was subsequently performed using RPLC-Q-Orbitrap with two different databases, reviewed and one protein sequence per gene. For metabolite analysis, water and methanol was compared as solvents based on quality of the Total Ion Chromatogram (TIC) within the m/z range of 50–1,000 and metabolites identified by RPLC-Q-ToF. Routine LC-MS/MS methods used for proteomic and metabolomic analyses were then evaluated.

The results demonstrated that soybean seed preparation up to phosphate buffer extraction was the optimal method, which produced a comprehensive SDS-PAGE protein band profile with minimal sample processing. Furthermore, the use of the one protein sequence per gene database increased the number of identified proteins to 56 protein groups, compared to only four proteins identified using the reviewed database. In metabolite analysis, TIC evaluation indicated that methanol was a more optimal solvent than water, as it generated a more stable baseline. However, based on the identified metabolites, both water and methanol exhibited different metabolite selectivities, suggesting that their complementary use enables more comprehensive metabolite identification. Evaluation of TIC profiles from routine LC-MS/MS methods for protein and metabolite analysis revealed an accumulation of hydrophobic peaks during the column washing phase. Therefore, the use of a shallower gradient is recommended for both methods to improve separation capacity.

Kata Kunci : proteomik, metabolomik, kacang kedelai, kromatografi cair, spektrometri massa, SDS-PAGE