Creation of pABC3 Plasmid Derivatives for Synthetic Biology and Protein-Protein Interaction Studies

Nazira Aydin Hatif, Apt. Setyowati Triastuti Utami; Erwin Lamping

2026 | Skripsi | FARMASI

Dalam beberapa tahun terakhir, teknologi Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) telah mengalami peningkatan signifikan dengan diperkenalkannya dua penanda protein baru, yaitu NanoLuc dan HaloTag. Kedua penanda ini menawarkan sensitivitas dan modularitas yang jauh lebih baik. Sayangnya, penggunaan sistem ini saat ini masih terbatas pada sistem ekspresi mamalia. Dalam penelitian ini, sistem ekspresi heterolog yang terdiri dari host cell Saccharomyces cerevisiae yang dimodifikasi secara genetik, AD Delta, dan plasmid pABC3 telah dimodifikasi sehingga teknologi NanoBRET ini juga dapat digunakan pada eukariotik host cell yang paling banyak dipelajari, yaitu S. cerevisiae. Selain itu, untuk memungkinkan integrasi stabil dua ORF heterolog secara tandem ke dalam lokus genomik PDR5 dari S. cerevisiae AD Delta—suatu langkah yang diperlukan untuk studi interaksi protein-protein—dua set tambahan plasmid turunan pABC3 dengan penanda seleksi URA3 yang dapat didaur ulang telah dibuat. Satu set plasmid (pABC3A dan turunan pABC3A) mengandung kaset blaster URA3 dengan penanda seleksi URA3 yang diapit oleh dua terminator PDR5 identik sepanjang 196 bp, dan set plasmid lainnya (pABC3B dan turunan pABC3B) mengandung kaset blaster URA3 yang memiliki dua terminator sintetis identik sepanjang 35 bp yang mengapit penanda seleksi URA3. Modifikasi-modifikasi ini akan membuka jalan bagi studi interaksi protein-protein yang lebih unggul dan untuk rekayasa metabolik pada galur inang S. cerevisiae yang dimodifikasi secara genetik, AD Delta.

In recent years, the Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) technology has undergone significant improvements with the introduction of two novel protein tags, NanoLuc and HaloTag. These two tags offer notably improved sensitivity and modularity. Unfortunately, the use of this system is currently limited to mammalian expression systems. In this study, the heterologous expression system consisting of the genetically modified Saccharomyces cerevisiae host strain, AD Delta, and plasmid pABC3 was modified so that this NanoBRET technology can also be used in arguably the best studied eukaryotic model host, S. cerevisiae. Furthermore, to allow the stable integration of two heterologous ORFs in tandem into the genomic PDR5 locus of S. cerevisiae AD Delta, a step required for protein protein interaction studies, two additional sets of pABC3 derivative plasmids with a recyclable URA3 selection marker were created. One set of plasmids (pABC3A and pABC3A derivatives) contains a URA3 blaster cassette with the URA3 selection marker flanked by two identical 196 bp PDR5 terminators and the other set of plasmids (pABC3B and pABC3B derivatives) contains a URA3 blaster cassette that has two identical 35 bp synthetic terminators flanking the URA3 selection marker. These modifications will pave the way for superior protein-protein interaction studies and for metabolic engineering in the genetically modified S. cerevisiae host strain, AD Delta.

Kata Kunci : Plasmid, pABC3, pABC3XL, pABC3A, pABC3B, synthetic terminator, URA3 blaster, NanoBRET, NanoLuc, HaloTag