Development of Antibacterial Compounds Based on Bioactive Peptides from Marine Macroalgae Chondrus crispus
Ahmad Habibie, Prof. Tri Joko Raharjo, S.Si., M.Si., Ph.D.; Respati Tri Swasono, S.Si., M.Phil., Ph.D.; Prof. Dr. Endah Retnaningrum, S.Si., M.Eng.
2025 | Disertasi | S3 Ilmu Kimia
Peptida antimikroba merupakan
alternatif yang menjanjikan untuk melawan resistensi antimikroba. Beberapa
kandidat AMP potensial ditemukan pada proteom makroalga Chondrus crispus. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan peptida
antimikroba bioaktif baru dari proteom makroalga Chondrus crispus.
Penelitian ini dimulai dengan skrining peptida menggunakan metode konvensional.
Protein yang diekstraksi dicerna oleh tripsin dan kimotripsin dan difraksinasi
oleh SPE-SCX dengan gradien pH 3-9. Semua fraksi diuji terhadap S. aureus,
dan sekuens peptida pada fraksi aktif ditentukan oleh LC-HRMS. Kandidat peptida
dipilih melalui analisis sifat fisikokimia, dan diuji pada bakteri dan
spektroskopi CD. Penambatan molekul terhadap DHFR dan DNA girase dilakukan
untuk menentukan mekanisme kerja peptida yang teridentifikasi terhadap bakteri.
Skrining kedua, skrining virtual, dilakukan dengan melakukan analisis sifat
fisikokimia dan analisis pembelajaran mesin dari data proteomik Chondrus
crispus untuk mendapatkan kandidat peptida terbaik. Peptida yang
teridentifikasi diuji pada bakteri dan dianalisis dengan spektroskopi CD untuk
helisitas. Langkah terakhir adalah optimasi struktur peptida teridentifikasi
yang diperoleh dari proses penyaringan. Semua peptida dimodifikasi oleh
beberapa mutasi dan modifikasi terminal menggunakan strategi rasional desain
peptida antimikroba untuk mengoptimalkan sifat fisikokimia peptida. Peptida
turunan residu non-alami dirancang dengan mensubstitusi valin dengan norvalin
dan leusin/isoleusin dengan norleusin. Sintesis peptida turunan residu tak
alami dilakukan dengan sintesis peptida fase padat. Peptida turunan diuji
terhadap E. coli dan S. aureus untuk menentukan MIC mereka. Spektroskopi
CD digunakan untuk perakitan sendiri struktur heliks dan studi stabilitas
peptida turunan. Studi NMR dan MD digunakan untuk menghasilkan struktur 3D dari
peptida terbaik. Mekanisme kerja peptida dipelajari melalui studi Langmuir-through
membran monolayer dan studi concentration dependent dengan
spektroskopi CD.
Skrining konvensional dengan fraksinasi
SPE-SCX menghasilkan beberapa fraksi aktif, dengan fraksi aktif terbaik adalah
kimotripsin pada pH 9, dengan zona inhibisi 14,4 mm. Tiga puluh satu sekuens
peptida baru diidentifikasi dari fraksi aktif, dengan P01 (KKNVTTLAPLVF)
menunjukkan sifat fisikokimia yang paling menjanjikan. Sayangnya, peptida
tersebut tidak menunjukkan aktivitas terhadap E. coli dan S. aureus
karena memiliki struktur sekunder random-coil. Studi docking molekuler
menunjukkan bahwa peptida fraksi aktif yang teridentifikasi menghambat
pertumbuhan bakteri dengan mengikat DHFR dan DNA girase. Tiga sekuens baru
dipilih dari studi skrining virtual FSTSSRALRFFR (CC1), RDLQQAISMVKK (CC2), dan
IAAKIQLLRSYR (CC3). Ketiga peptida menunjukkan struktur heliks, dengan CC2 dan
CC3 menunjukkan heliksitas tertinggi, masing-masing 47,7 dan 44,7%. Dalam
penelitian ini, hanya CC1 dan CC3 yang menunjukkan aktivitas terhadap E.
coli dengan MIC masing-masing >250 dan 226,2 ?g mL–1.
Peptida turunan dihasilkan dari
pendekatan rasional desain peptida antimikroba dengan mengoptimalkan sifat
fisikokimianya. P01.3 (Ac-KKIVEILKKLVK-NH2), yang dihasilkan dari P01,
menunjukkan MIC masing-masing 3,91 dan 15,63 ?g mL–1
terhadap E. coli dan S. aureus. P01.3 menunjukkan struktur
sekunder ?-heliks
amfipatik dengan hidrofobisitas 0,321 dan hidrofobisitas residu rata-rata
0,821. Peptida turunan terbaik dari skrining virtual adalah CC1d
(Ac-FKLLKRLLRFFR-NH2) dengan MIC masing-masing 7,12 dan 3,19 ?g
mL–1 terhadap E. coli dan S. aureus. Turunan ini
menunjukkan struktur ?-heliks
amfipatik dengan tingkat hidrofobisitas 0,433 dan tingkat hidrofobisitas residu
rata-rata 0,681. Uji stabilitas fisik dengan CD menunjukkan bahwa semua peptida
turunan relatif stabil hingga suhu 85 °C dan pH sekitar 3–8. Studi konformasi
menunjukkan bahwa P01.3 dan CC1d memiliki struktur heliks dengan kekerasan yang
kemungkinan masing–masing terdapat di terminal-N dan terminal-C. Studi membran
menunjukkan bahwa semua turunan membunuh bakteri melalui disrupsi membran.
Mekanisme aksi karpet ditunjukkan oleh CC1d, berbeda dari peptida lain yang
membunuh bakteri melalui insersi membran.
UP013, sebagai peptida turunan
non-alami dari P01.3, menunjukkan aktivitas terbaik di antara peptida turunan
residu non-alami dengan MIC masing-masing 2,43 dan 16,08 ?g
mL–1 terhadap E. coli dan S. aureus. Semua peptida
turunan residu non-alami menunjukkan stabilitas fisik yang baik pada suhu 85 °C
dan pH 3–8 dengan perubahan struktur minimal. Konformasi dan struktur sekunder
menunjukkan bahwa UP013 memiliki heliksitas yang lebih baik dibandingkan
peptida induknya (P01.3) dengan sudut dihedral yang lebih kecil dan tidak ada
deviasi struktur heliks.
Antimicrobial
peptide is a promising alternative to fight antimicrobial resistance. Several
potential AMP candidates were identified in the proteome of the macroalgae Chondrus
crispus. Hence, the current study aims to develop new bioactive
antimicrobial peptides from the proteome of the Chondrus crispus macroalgae.
The current study began with the screening of the peptide using a conventional
method. The extracted protein was digested with trypsin and chymotrypsin and
then fractionated using SPE-SCX with a pH gradient of 3-9. All fractions were
tested against S. aureus, and peptide sequences on active fractions were
determined by LC-HRMS. The peptide candidate was selected based on
physicochemical properties analysis and subsequently tested on bacteria and by
CD spectroscopy. Molecular docking against DHFR and DNA gyrase was performed to
elucidate the mechanism of action of the identified peptide against bacteria.
The second virtual screening was conducted by analyzing the physicochemical
properties and machine learning of the Chondrus crispus proteomic data
to determine the best peptide candidate. The identified peptides were tested on
bacteria and analyzed by CD spectroscopy for helicity. The final step involved
optimizing the structure of the identified peptides obtained from the screening
processes. All peptides were modified by several mutations and terminal
modifications using a rational design antimicrobial peptide strategy to
optimize their physicochemical properties. Unnatural residue unnatural
derivative peptides were designed by substituting valine with norvaline and
leucine/isoleucine with norleucine. The synthesis of unnatural residue
derivative peptides was conducted using solid-phase peptide synthesis. The
derivative peptides were tested against E. coli and S. aureus to
determine their MIC. The CD spectroscopy was used for helical structure
self-assembly and stability studies of derivative peptides. NMR and MD studies generated
3D structures of the best peptide. The peptide’s mechanism of action was
studied by monolayer membrane Langmuir-through and CD concentration-dependent
studies.
The
conventional screening by SPE-SCX fractionation yielded several active
fractions, with the most active fraction of chymotrypsin at pH 9, exhibiting an
inhibition zone of 14.4 mm. Thirty-one new peptide sequences were identified from active fractions,
with P01 (KKNVTTLAPLVF) showing the most
promising physicochemical properties. Unfortunately, due to its random coil
secondary structure, the peptide exhibited zero activity against E. coli
and S. aureus. The molecular docking study suggests that the identified active
fraction peptide inhibited bacterial growth by binding DHFR and DNA gyrase. Three
new sequences were selected from a virtual screening study of FSTSSRALRFFR (CC1), RDLQQAISMVKK (CC2), and
IAAKIQLLRSYR (CC3). The three peptides exhibited a helical structure, with CC2
and CC3 showing the highest helicity of 47.7% and 44.7%, respectively. In this
study, only CC1 and CC3 exhibited activity against E.
coli with MICs of >250 and
226.2 ?g mL–1, respectively.
Derivative peptides were obtained through a
rational design approach to optimize the physicochemical properties of
antimicrobial peptides. P01.3 (Ac-KKIVEILKKLVK-NH2),
driven from P01<!--[if !supportAnnotations]-->[TR1]<!--[endif]--> , exhibited MIC of 3.91 and 15.63 ?g mL–1
against E. coli and S. aureus, respectively. P01.3 exhibited an
amphipathic ?-helix secondary structure with 0.321 hydrophobicity and 0.821 hydrophobic
moment. The best derivative peptide from virtual screening was CC1d (Ac-FKLLKRLLRFFR-NH2) <!--[if !supportAnnotations]-->[TR2]<!--[endif]--> with MICs of 7.12 and 3.19 ?g mL–1
against E. coli and S. aureus, respectively. The derivative exhibited
an amphipathic ?-helix structure with a hydrophobicity of 0.433 and a
hydrophobic moment of 0.681. The physical stability assay by CD showed that all
derivative peptides were relatively stable up to a temperature of 85 °C and a
pH range of approximately 3–8. The conformational study revealed that P01.3 and
CC1d possess helical structures, with violence likely present in the N-terminal
and C-terminal regions, respectively. A membrane study showed that all
derivatives killed bacteria through membrane disruption. A mechanism of action
for CC1d was demonstrated, which differs from that of other peptides that kill
bacteria by inserting into the membrane<!--[if !supportAnnotations]-->[TR3]<!--[endif]--> .
UP013, an unnatural derivative peptide of P013, exhibited the best activity among unnatural residue derivative peptides with MICs of 2.43 and 16.08 ?g mL–1 against E. coli and S. aureus, respectively. All unnatural residue derivative peptides exhibited good physical stability at 85 °C and pH levels ranging from 3 to 8, with minimal structural changes. The conformational and secondary structure analysis revealed that UP013 exhibits better helicity than its parent peptide (P01.3), characterized by a smaller dihedral angle and no deviation from the helix structure.
Kata Kunci : antimicrobial peptide, antibacterial agent, exploration, development
