Identification of the npr Gene in Geobacillus sp. DS3 Through A Genomic Approach and Its Expression Analysis in Escherichia coli BL21 (DE3)

Violinsky Vindy, Dr.rer.Nat. Lucia Dhiantika Witasari, S.Farm., Apt., M.Biotech; Muhammad Saifur Rohman, S.P., M.Si., M.Eng., Ph.D.

2025 | Tesis | S2 Ilmu dan Teknologi Pangan

Protease netral adalah biokatalisator yang sangat penting dan banyak digunakan dalam industri makanan karena aktivitasnya yang optimal pada pH netral. Namun, aplikasi industri dari protease ini sering terbatas oleh stabilitas termalnya yang rendah. Dalam penelitian ini, genom Geobacillus sp. DS3, bakteri termofilik yang diisolasi dari Dataran Tinggi Dieng, dianalisis melalui Whole Genome Sequencing (WGS) untuk mengidentifikasi keberadaan gen npr yang mengkode protease netral yang stabil terhadap suhu. Gen npr kemudian dikloning ke dalam vektor pET-SUMO dan ditransformasikan ke dalam Escherichia coli BL21 (DE3) untuk ekspresi heterolog. Transformasi dikonfirmasi melalui PCR koloni, dan ekspresi protein diverifikasi menggunakan SDS-PAGE. Optimasi ekspresi dilakukan dengan memvariasikan suhu induksi, waktu, dan konsentrasi IPTG. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekspresi tertinggi terjadi pada suhu 18°C dengan konsentrasi IPTG 0,1–0,9 mM. Namun, protein yang diekspresikan sebagian besar tidak larut dan terakumulasi dalam inklusi tubuh. Meskipun ekspresi berhasil, uji aktivitas enzimatik mengungkapkan bahwa protease rekombinan tidak menunjukkan aktivitas yang signifikan, kemungkinan disebabkan oleh kesalahan pelipatan atau pemotongan diri selama ekspresi. Temuan ini menyoroti potensi genomik Geobacillus sp. DS3 sebagai sumber protease yang stabil terhadap suhu dan menekankan perlunya optimasi lebih lanjut untuk mendapatkan enzim yang aktif secara fungsional.

Neutral proteases are essential biocatalysts widely used in the food industry due to their optimal activity at neutral pH. However, their industrial application is often limited by low thermal stability. In this study, the genome of Geobacillus sp. DS3, a thermophilic bacterium isolated from the Dieng Plateau, was analyzed through whole genome sequencing (WGS) to identify the presence of the npr gene encoding a thermostable neutral protease. The npr gene was then cloned into the pET-SUMO vector and transformed into Escherichia coli BL21 (DE3) for heterologous expression. The transformation was confirmed by colony PCR, and protein expression was verified by SDS-PAGE. Expression optimization was performed by varying induction temperature, time, and IPTG concentration. The results showed that the highest expression occurred at 18°C with 0.1–0.9 mM IPTG. However, the expressed protein was mostly insoluble and accumulated in inclusion bodies. Despite successful expression, enzymatic activity assays revealed that the recombinant protease lacked significant activity, likely due to improper folding or self-cleavage during expression. These findings highlight the genomic potential of Geobacillus sp. DS3 as a source of thermostable protease and emphasize the need for further optimization to obtain a functionally active enzyme.

Kata Kunci : Geobacillus sp. DS3, thermostable neutral protease, npr gene, recombinant expression, E. coli BL21(DE3), inclusion body, whole genome sequencing