Ekspresi Protein Penisilin G-Asilase Mutan Beta Phe256tyr Pada Escherichia coli Bl21(De3) Dan Analisis Aktivitas Enzimnya

Niluh Gede Eka Cristina Mulyani, Dr. apt. Purwanto, M.Sc.; Prof. Dr. apt. Sismindari, S.U.

2025 | Tesis | S2 Bioteknologi

Amoksisilin merupakan antibiotik yang banyak digunakan di Indonesia, dan dalam produksinya membutuhkan 6-aminopenicillanic acid (6-APA) sebagai precursor yang diperoleh melalui hidrolisis penisilin G oleh enzim Penisilin G asilase (PGA). Enzim tersebut dapat ditemukan pada mkroorganisme seperti E. coli, meskipun jumlahnya rendah. Upaya peningkatan ekspresi dan aktivitas enzim PGA telah dilakukan melalui perancangan mutan menggunakan molecular docking, yang menghasilkan empat mutan potensial: ?Phe256Arg, ?Phe256Tyr, ?Leu253Met, dan ?Thr68Tyr. Mutan ?Thr68Tyr telah diekspresikan, namun aktivitasnya tidak berbeda jauh dari PGA wild type. Oleh karena itu pada penelitian ini akan diekspresikan mutan ?Phe256Tyr pada E. coli BL21 (DE3) untuk meningkatkan aktivitas enzim PGA.

Pada penelitian ini gen sintetik pengkode enzim PGA mutan ?Phe256Tyr ditransformasikan ke E.coli BL21 (DE3). Koloni transforman kemudian dikonfirmasi dengan PCR dan sekuensing. Protein PGA mutan ?Phe256Tyr dan ?Thr68Try diekspresikan dengan penambahan IPTG sebagai induser. Fraksi protein kemudian diisolasi dan digunakan untuk uji aktivitas enzim dengan substrat penisilin G. Hasil uji aktivitas kemudian dibandingkan antar isolat PGA mutan ?Phe256Tyr, ?Thr68Try dan kontrol plasmid. 

Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa protein PGA mutan ?Phe256Tyr berhasil diekspresikan yang ditunjukkan dengan adanya sub-unit ? dari enzim PGA pada hasl SDS-PAGE. Total protein dari fraksi S1, S2, P1 dan P2 dari masingmasing isolat yaitu 46,11 mg, 1,90 mg, 68,10 mg dan 40,53 mg (kontrol plasmid); PGA mutan Thr68Tyr yaitu 50,96 mg, 2,98 mg, 311,33 mg dan 241,38 mg; PGA mutan Phe256Tyr yaitu 52,08 mg, 2,40 mg, 259,01 mg dan 213,62 mg. Hasil uji aktivitas enzim dari kontrol plasmid, PGA mutan ?Thr68Try dan PGA mutan ?Phe256Tyr secara berurutan yaitu 0,016 U/mg, 0,019 U/mg dan 0,014 U/mg untuk fraksi S1, sedangkan untuk fraksi S2 0,046 U/mg, 0,063 U/mg dan 0,068 U/mg. Berdasarkan hasil tersebut dapat disimpulkan bahwa proses mutasi pada residu asam amino Phe256 maupun Thr68 yang diganti dengan Tyr tidak memberikan efek yang berbeda pada akivitas enzim.

Amoxicillin is among the most commonly used antibiotics in Indonesia, and its production depends on 6-aminopenicillanic acid (6-APA), which is derived from the hydrolysis of penicillin G using the enzyme penicillin G acylase (PGA). This enzyme is naturally produced by microorganisms like E. coli, although only in small amounts. To enhance its activity and expression, mutant variants of PGA have been designed through molecular docking studies, resulting in four potential candidates: ?Phe256Arg, ?Phe256Tyr, ?Leu253Met, and ?Thr68Tyr. While the?Thr68Tyr mutant has been previously expressed, its enzymatic activity was not significantly different from the wild-type. Therefore, this study focuses on expressing and analyzing the ?Phe256Tyr mutant in E. coli BL21 (DE3) to evaluate its potential for increased activity.

The synthetic gene coding for the ?Phe256Tyr mutant was transformed into E. coli BL21 (DE3), and the resulting colonies were confirmed using PCR and DNA sequencing. Protein expression was induced using IPTG, and the resulting mutant proteins ?Phe256Tyr and ?Thr68Tyr were isolated into different fractions for enzyme activity assays using penicillin G as the substrate. The activities of both mutants were compared with a plasmid control.

SDS-PAGE analysis confirmed successful expression of the ?Phe256Tyr mutant by showing the presence of the ? subunit. Total protein in S1, S2, P1, and P2 fractions were measured: for the control (46.11, 1.90, 68.10, and 40.53 mg), ?Thr68Tyr (50.96, 2.98, 311.33, and 241.38 mg), and ?Phe256Tyr (52.08, 2.40, 259.01, and 213.62 mg). Enzyme activities (U/mg) in S1 and S2 fractions were 0.016/0.046 (control), 0.019/0.063 (?Thr68Tyr), and 0.014/0.068 (?Phe256Tyr). These results suggest that substituting Phe256 and Thr68 with Tyr does not significantly alter PGA enzymatic activity.

Kata Kunci : 6-aminopenicillanic acid, aktivitas Enzim, Mutasi, Penicillin G asilase, PGA mutan, /6-aminopenicillanic acid, Enzyme Activity, Mutation, Penicillin G acylase, PGA mutant,