Studi Komparasi: Pengaruh Media Fermentasi BS dan SDB terhadap Aktivitas Sitotoksik Fungi Trichoderma reesei TV221

Nurhaliza, Prof. Dr. apt. Erna Prawita Setyowati, M.Si.; Dr. apt. Riris Istighfari Jenie, M.Si.

2025 | Tesis | S2 Ilmu Farmasi

Fungi Trichoderma reesei TV221 mampu menghasilkan senyawa N-ethyl-4-(2-((10-methylundecyl)oxy)ethyl)aniline (NMO) yang memiliki aktivitas sitotoksik kuat terhadap sel kanker WiDr dengan nilai IC?? 31,46 µg/mL. Meskipun senyawa ini berpotensi untuk dikembangkan lebih lanjut, penelitian sebelumnya menghadapi kendala berupa rendahnya perolehan rendemen ekstrak, yakni 0,038% b/v menggunakan media Sabouraud Dextrose Broth (SDB). Jenis media fermentasi merupakan faktor penting yang memengaruhi rendemen ekstrak. Media beras steril (BS) kini banyak digunakan sebagai alternatif karena memiliki kadar air rendah yang memicu stres ringan pada fungi sehingga meningkatkan produksi metabolit sekunder. Penelitian ini bertujuan untuk mengkomparasi efektivitas fermentasi baik menggunakan media BS atau pun SDB dalam menghasilkan senyawa sitotoksik pada sel kanker WiDr.

Penelitian ini meliputi tahapan kultivasi, fermentasi, ekstraksi, uji sitotoksik, identifikasi senyawa NMO, dan profiling kimia. Fungi T. reesei TV221 dikultivasi pada media Saboraud Dextrose Agar (SDA) selama 7 hari, kemudian difermentasi pada media BS selama 30 hari (dipanen dua hari sekari) dan SDB selama 12 hari (dipanen satu kali). Ekstraksi menggunakan pelarut etil asetat dilakukan dengan metode padat-cair untuk media BS dan cair-cair untuk media SDB. Ekstrak etil asetat diuji aktivitas sitotoksik dengan metode MTT pada sel kanker WiDr dan sel normal Vero untuk menentukan viabilitas sel, IC??, dan indeks selektivitas. Keberadaan senyawa NMO diidentifikasi menggunakan KLT, sedangkan profiling kimia dilakukan dengan LC-HRMS.

Fermentasi T. reesei TV221 pada media BS menghasilkan 15 ekstrak etil asetat (A–O). Hasil skrining sitotoksik awal terhadap sel WiDr menggunakan konsentrasi 100 µg/mL menunjukkan bahwa ekstrak F, J, dan N memiliki viabilitas sel terendah masing-masing 51,33%, 51,01%, dan 42,88%. Nilai IC?? ketiga ekstrak tersebut secara berturut-turut 185,91; 141,68; dan 99,93 µg/mL serta indeks selektivitas 1,34; 3,89; dan 5,57. Ekstrak N yang dipanen pada hari ke-28 dipilih sebagai ekstrak terbaik karena memiliki IC?? terendah dan indeks selektivitas tertinggi. Rendemen ekstrak N hasil fermentasi media BS diperoleh sebesar 0,198% yang berarti 5,2 kali lebih banyak dari pada media SDB. Keberadaan NMO dalam ekstrak BS terindikasi dari bercak KLT dengan nilai Rf yang sama seperti standar NMO. Berdasarkan data LC-HRMS, ekstrak BS memiliki kadar relatif NMO 6,6 kali lebih rendah dari pada ekstrak SDB. Selanjutnya, analisis LC-HRMS mengidentifikasi sepuluh senyawa metabolit sekunder bioaktif mayor baik dari ekstrak BS atau pun SDB, di mana terdapat satu senyawa yang ditemukan pada kedua ekstrak, yaitu 8-Deoxylankolide. Berdasarkan analisis database, diantara sepuluh senyawa mayor, 7 senyawa dari ekstrak BS dan 7 senyawa dari SDB terindikasi memiliki aktivitas sitotoksik. Hal ini berarti bahwa media BS berpotensi digunakan sebagai media alternatif karena mampu meningkatkan produksi metabolit sekunder dan mempertahankan aktivitas sitotoksik pada sel WiDr.

Trichoderma reesei TV221 is capable of producing N-ethyl-4-(2-((10-methylundecyl)oxy)ethyl)aniline (NMO), a compound with strong cytotoxic activity against WiDr cancer cells, exhibiting an IC?? value of 31.46 µg/mL. Although this compound holds promise for further development, previous studies encountered limitations due to the low extract yield, which was only 0,038% b/v when using Sabouraud Dextrose Broth (SDB). The type of fermentation medium is a critical factor influencing extract yield. Sterile rice (BS) medium has recently gained attention as an alternative due to its low moisture content, which induces mild stress in fungi and stimulates the production of secondary metabolites. This study aims to compare the effectiveness of BS and SDB media in producing cytotoxic compounds against WiDr cancer cells.

The research involved stages of cultivation, fermentation, extraction, cytotoxicity assay, NMO identification, and chemical profiling. T. reesei TV221 was first cultivated on Sabouraud Dextrose Agar (SDA) for seven days, followed by fermentation on BS medium for 30 days (with sampling every two days) and on SDB medium for 12 days (single sampling). Extraction was carried out using ethyl acetate as the solvent, applying solid-liquid extraction for BS and liquid-liquid extraction for SDB. Cytotoxic activity of the ethyl acetate extracts was tested against WiDr cancer cells and Vero normal cells using the MTT assay to determine cell viability, IC??, and selectivity index. The presence of NMO was confirmed using Thin Layer Chromatography (TLC), while chemical profiling was performed using LC-HRMS.

Fermentation of T. reesei TV221 on BS medium yielded 15 ethyl acetate extracts (A–O). Initial cytotoxic screening at a concentration of 100 µg/mL revealed that extracts F, J, and N showed the lowest cell viability, at 51.33%, 51.01%, and 42.88%, respectively. Their IC?? values were 185.91, 141.68, and 99.93 µg/mL, with selectivity index of 1.34, 3.89, and 5.57, respectively. Extract N, obtained on day 28, was selected as the most promising extract due to its lowest IC?? and highest selectivity index. The yield of N extract from the fermentation of BS media was 0.198%, which means 5.2 times more than SDB media. The presence of NMO in the BS extract was indicated by a TLC spot with an Rf value identical to that of the NMO standard. However, LC-HRMS analysis revealed that the relative concentration of NMO in the BS extract was 6.6 times lower than that in the SDB extract. Further LC-HRMS analysis identified ten major bioactive secondary metabolites in both BS and SDB extracts, with one compound, 8-Deoxylankolide, being common to both. Database analysis indicated that eight of the ten major compounds in the BS extract and seven in the SDB extract possess potential cytotoxic activity. These findings suggest that BS medium has strong potential as an alternative fermentation medium, as it enhances secondary metabolite production while maintaining cytotoxic activity against WiDr cancer cells.

Kata Kunci : Fungi asosiasi spons, Trichoderma reesei TV221, Media beras steril, Solid-state fermentation, kanker kolorektal