Penyuntingan Gen PaEFL2 pada Genom Tanaman Anggrek Bulan (Phalaenopsis amabilis (L.) Blume) dengan Sistem CRISPR/Cas9 melalui Agroinfiltrasi

SHIDDHARTA ARYA ANGGORO CEN, Prof. Dr. Endang Semiarti, M.S., M.Sc.

2025 | Skripsi | BIOLOGI

Anggrek bulan (Phalaenopsis amabilis (L.) Blume) sering digunakan sebagai induk persilangan untuk menghasilkan beragam bunga anggrek yang menarik dan bernilai ekonomi tinggi. Namun, anggrek ini memiliki fase vegetatif yang panjang yaitu sekitar 2-3 tahun untuk sampai tahap berbunga. Upaya untuk memperpendek fase vegetatif tanaman anggrek dilakukan dengan menginaktivasi fungsi salah satu gen yang menghambat pembungaan, yaitu EFL2 (EARLY FLOWERING 4-LIKE 2), menggunakan teknologi genom editing dengan CRISPR/Cas9. Agroinfiltrasi merupakan metode transfer T-DNA yang efektif digunakan pada tanaman, dengan tingkat efisiensi mencapai 100%. Permasalahan utama metode ini adalah timbulnya pencoklatan jaringan di sekitar bekas luka, serta integrasi T-DNA yang bersifat transien dan terbatas pada situs agroinfiltrasi. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan metode penyuntingan gen EFL2 pada tanaman anggrek P. amabilis dengan sistem CRISPR/Cas9 menggunakan metode transfer agroinfiltrasi yang mudah dan efisien. Metode yang digunakan meliputi: 1) Transfer plasmid pRGEB32 ke Agrobacterium tumefaciens GV3101 dengan freeze thaw, 2) Deteksi konstruk gRNA dalam sistem CRISPR/Cas9 dengan PCR, 3) Transfer T-DNA pembawa konstruksi CRISPR/Cas9 terhadap gen EFL2 ke genom tanaman anggrek dengan agroinfiltrasi pada midrib daun, 4) Pemberian vitamin C dan balsam Zam-Buk pada luka agroinfiltrasi untuk meminimalisir pencoklatan, 5) Analisis efisiensi metode penyuntingan genom. Hasil menunjukkan teknik agroinfiltrasi terbaik untuk tanaman anggrek P. amabilis dilakukan menggunakan syringe pada midrib daun muda dengan penambahan vitamin C sebanyak 0,56 mM pada buffer MMA, lalu luka injeksi ditutup dengan salep Zam-Buk. Analisis PCR menunjukkan bahwa integrasi T-DNA terdistribusi ke seluruh organ tanaman dengan efisiensi 100%, kecuali pada bagian ujung daun perlakuan dan akar yang pangkalnya mengalami pembusukan. Hasil sekuensing Sanger menunjukkan bahwa mutasi gen PaEFL2 dapat diinduksi dengan metode genom editing menggunakan teknologi CRISPR/Cas9.

The moth orchid (Phalaenopsis amabilis (L.) Blume) is frequently used as a parent in hybridization to produce diverse orchid flowers with high economic value and aesthetic appeal. However, this orchid has a long vegetative phase, requiring approximately 2-3 years to bloom. Efforts to shorten the vegetative phase can be achieved by inactivating the function of a flowering suppressor gene, namely the EFL2 gene, using the CRISPR/Cas9 system. Agroinfiltration is an effective T-DNA delivery technique for orchids, with an efficiency of up to 100%. However, the main issue with this method is the browning of tissues around the wound site and the transient and localized integration of T-DNA at the agroinfiltration site. Therefore, this study aimed to develop a method for editing the EFL2 gene in P. amabilis orchid using CRISPR/Cas9 through a simple and efficient agroinfiltration transfer technique. The methods used include: 1) Transferring the pRGEB32 plasmid into Agrobacterium tumefaciens GV3101 cells via freeze-thaw technique, 2) Detecting gRNA constructs in the CRISPR/Cas9 system via PCR, 3) Transferring T-DNA carrying the CRISPR/Cas9 construct into the P. amabilis orchids genome through agroinfiltration of the leaf midrib, 4) Applying vitamin C and Zam-Buk balm to the agroinfiltration wounds to minimize browning, and 5) Analyzing the efficiency of the genome editing method. The results showed the best agroinfiltration method for P. amabilis orchids involves using a syringe on the midrib of young leaves with the addition of 0,56 mM vitamin C into the MMA buffer, then sealing the wound with Zam-Buk balm. PCR analysis showed that T-DNA integration was distributed throughout the plants organ with 100?ficiency, except in the tip of the treated leaves and in roots with rotten basal. Sanger sequencing results indicated that mutations in PaEFL2 gene can be induced using genome editing method with CRISPR/Cas9 technology.

Kata Kunci : Phalaenopsis amabilis, Gen EFL2, CRISPR/Cas9, Agroinfiltrasi