Studi Lymphocystis Disease Virus: Identifikasi, Karakterisasi, Kajian Rentang Inang, Desain Primer Metode Deteksi, dan Over Ekspresi Penyandi MCP sebagai Kandidat Vaksin.
NUR LAILATUL FITROTUN NIKMAH, Prof. Dr. Ir. Murwantoko., M.Si; Prof. Dr. Ir. Alim Isnansetyo, M.Sc; Indah Istiqomah, S.Pi., M.Si., Ph.D.
2024 | Disertasi | S3 Ilmu Pertanian
Penyakit pada ikan muncul karena ketidakseimbangan faktor lingkungan, ikan, dan patogen. Faktor ikan yang berperan dalam munculnya penyakit adalah imunitas rendah, stres, dan strain rentan. Faktor patogen yang berperan adalah sifat resistensi, strain virulen, karier, dan vektor. Penyakit limfosistis adalah salah satu penyakit virus yang mengakibatkan mortalitas dan penurunan nilai serta kerugian ekonomi. Lymphocystis Disease Virus (LCDV) merupakan agen etiologi penyakit limfosistis. Disertasi ini terbagi menjadi empat penelitian yaitu identifikasi dan karakterisasi, kajian rentang inang, desain primer metode deteksi, dan over ekspresi gen penyandi Major Capsid Protein (MCP) sebagai kandidat vaksin. Wabah penyakit limfosistis akibat LCDV pada ikan gabus Channa striata di Kalimantan Selatan dengan gejala klinis kutil di permukaan tubuh. Pemeriksaan histopatologi menunjukkan adanya badan inklusi basofilik intrasitoplasmik di kutil, serta adanya peradangan pada viscera. Peradangan ditandai dengan akumulasi sel inflamasi, hemorrhagi, dan nekrosis. Identifikasi dan karakterisasi molekuler dilakukan dengan mengurutkan serta analisis homologi gen MCP, MMP, DNAmet, DNApolB, RNR-L, dan DNAprim. Identifikasi menunjukkan LCDV sebagai agen etiologis penyakit limfosistis pada ikan gabus Channa striata sehingga dinamakan LCDV Cs-SK. Karakterisasi molekuler menunjukkan LCDV Cs-SK dengan homologi tinggi dengan LCDV Oc-Btm yang menginfeksi ikan badut A. percula di Batam, namun memiliki homologi rendah (>91.37%) dengan spesies LCDV. Analisis pohon filogenetik enam gen, LCDV Cs-SK menunjukkan klad yang berbeda pada gen DNAmet, sedangkan pohon filogenetik concacenated menunjukkan kekerabatan terdekat dengan LCDV-3. Homologi nukleotida yang rendah dan perbedaan klad pada analisis pohon filogenetik menunjukkan bahwa LCDV Cs-SK berkemungkinan menjadi spesies LCDV yang baru. Kajian rentang inang dilakukan dengan menginfeksikan filtrat virus pada ikan penting di Indonesia yaitu Osphronemus goramy, Betta sp., Oreochromis sp., Clarias sp., dan Cyprinus carpio. Viral load (MCP copy number/mg jaringan) tinggi teramati pada keseluruhan spesies ikan di organ yang berbeda hingga akhir masa pengamatan. Hal ini menunjukkan bahwa kelima spesies ikan penting di Indonesia rentan terhadap infeksi LCDV. Enam set primer didesain berdasarkan urutan MCP LCDV Cs-SK dari penelitian sebelumnya (karakterisasi molekuler) untuk aplikasi kuantitatif qPCR dengan plasmid rekombinan sebagai standar kuantitatif. Efisiensi dan sensitivitas set primer ditentukan menggunakan analisis regresi linier antara Ct dan kuantitas plasmid rekombinan. Primer MCP-6 memiliki sensitivitas lebih tinggi dan durasi lebih singkat dibandingkan primer referensi. Primer MCP-6 mampu mendeteksi dan mengkuantifikasi viral load pada ikan simptomatik dan asimptomatik. MCP LCDV Cs-SK dikloning pada vektor pET 32a dengan memanfaatkan enzim Eco R1 dan Hind III, serta ekspresi protein dilakukan dengan menginduksi IPTG. Berdasarkan prediksi epitop, MCP LCDV Cs-SK berpotensi imunogenik, mampu dikenali limfosit T dan B. Over ekspresi MCP menghasilkan protein pada fraksi soluble dan insoluble berukuran 58 kDa – 63 kDa. Protein MCP LCDV Cs-SK sebagai kandidat vaksin nantinya dapat mendukung kegiatan pencegahan penyakit limfosistis.
Diseases in fish are due to an imbalance factor in environmental, fish, and pathogens. Fish factors that play a role in the emergence of disease are low immunity, stress, and susceptible strains. Pathogenic factors that play a role are resistance, virulent strains, less specific diagnostic tools, carriers, and vectors. Lymphocystis disease is a viral disease that causes mortality and economic losses. Lymphocystis Disease Virus (LCDV) is the etiological agent of lymphocystis disease. This dissertation is divided into four studies, namely identification and characterization, host range assessment, primer design for detection methods, and overexpression of the gene encoding Major Capsid Protein (MCP) as a vaccine candidate. Outbreak of lymphocystis disease in snakehead fish in South Kalimantan with clinical symptoms of warts on the body surface. Histopathological examination showed the presence of intracytoplasmic basophilic inclusion bodies in the warts, as well as inflammation of the internal organs. Inflammation is characterized by the accumulation of inflammatory cells, hemorrhage, and necrosis. Molecular identification and characterization by sequencing and homology analysis of the MCP, MMP, DNAmet, DNApolB, RNR-L, and DNAprim genes. Identification showed LCDV as the etiological agent of lymphocystis disease in snakehead fish Channa striata, so it was named LCDV Cs-SK. Molecular characterization shows that LCDV Cs-SK has high homology with LCDV Oc-Btm, which infects the clownfish A. percula in Batam, but has low homology (>91.37%) with LCDV species. Analysis the phylogenetic tree of six genes, LCDV Cs-SK shows a different clade in the DNAmet gene, while the concacenated phylogenetic tree shows the closest relationship with LCDV-3. Low nucleotide homology and clade differences in phylogenetic tree analysis indicate that LCDV Cs-SK is possible to be a new LCDV species. Host range studies were carried out by infecting virus filtrates in important fish in Indonesia, namely Osphronemus goramy, Betta sp., Oreochromis sp., Clarias sp., and Cyprinus carpio. High viral loads (MCP copy number/mg tissue) were observed in all fish species in different organs until the end of the observation period. This shows that the five important fish species in Indonesia are susceptible to LCDV infection. Six sets of primers were designed based on the LCDV Cs-SK MCP sequence from previous studies (molecular characterization) for quantitative qPCR applications with recombinant plasmids as quantitative standards. Primer efficiency and sensitivity were determined using linear regression analysis between Ct and quantity of recombinant plasmid. The MCP-6 primer has higher sensitivity and a shorter duration than the primer reference. The MCP-6 primer is able to detect and quantify viral loads in symptomatic and asymptomatic fish. MCP LCDV Cs-SK was cloned in the pET 32a vector using the Eco R1 and Hind III enzymes, and protein expression was carried out by inducing IPTG. Based on epitope predictions, MCP LCDV Cs-SK has the potential to be immunogenic, able to recognize T and B lymphocytes. Overexpression of MCP produces proteins in the soluble and insoluble fractions measuring 58 kDa–63 kDa. LCDV Cs-SK MCP protein as a vaccine candidate can later support preventive activities for lymphocystis disease.
Kata Kunci : penyakit limfosistis, karakterisasi molekuler, spesies baru, rentang inang, qPCR
