Studi Represi Katabolit Karbon terhadap Produksi Endo-xilanase dan ?-xilosidase pada Jamur melalui Analisis Transkriptomik

Ririn Krisnawati, Dr. Muhammad Nur Cahyanto, M.Sc.; Ir. Jaka Widada, M.P., Ph.D.; Dr. Dian Anggraini Suroto, S.TP., M.Sc., M.Eng.

2024 | Disertasi | S3 Ilmu Pangan

Xilanase terdiri dari endo-xilanase dan ?-xilosidase. Keduanya diproduksi oleh berbagai jamur dengan tingkat produksi yang berbeda-beda. Produksi enzim oleh mikrobia unggul dibutuhkan untuk mendapatkan yield yang besar. Namun produksi xilanase dibatasi oleh adanya represi katabolit, yaitu adanya hasil pemecahan polimer xilan yang akan menghambat produksi enzim-enzim tersebut. Oleh sebab itu, untuk meningkatkan produksi xilanase biasanya dilakukan dengan menghilangkan represi katabolit atau menambah jumlah gen penyandi enzim tersebut. Informasi tentang bagaimana cara kerja gen penyandi represor kunci dan gen lainnya yang berhubungan dengan represi katabolit perlu untuk diketahui. Analisis transkriptomik diharapkan dapat memberikan informasi tersebut sehingga dapat memberikan infromasi mengenai terjadinya represi katabolit pada jamur.  Pada penelitian ini dilakukan pengukuran kemampuan beberapa jamur dalam memproduksi endo-xilanase dan ?-xilosidase serta respon jamur terhadap glukosa sebagai represor dan analisis transkriptomik dari jamur yang produksi xilanasenya mengalami represi katabolit. Empat belas jamur diinokulasikan dalam medium padat dan cair yang terdiri dari xilan dan xilan ditambahkan dengan glukosa sebagai represor (0, 1, 3, dan 5%) kemudian dilakukan pengukuran produksi endo-xilanase dan ?-xilosidase. Untuk analisis transkriptomik, RNA miselium jamur diisolasi dan disekuen urutan basa nitrogennya diikuti dengan analisis perbedaan gen ekspresi. Analisis transkriptomik dilakukan pada A. tubingensis FNCC 6114 yang ditumbuhkan pada media xilan dan xilan yang ditambahkan 5% glukosa. Hasil penelitian menunjukkan dari ke-14 galur yang dianalisis, A. tubingensis FNCC 6114 menghasilkan endo-xilanase dan ?-xilosidase tertinggi. Namun untuk galur lain, tidak menunjukan hal serupa. A. aculeatus FIG1 menghasilkan endo-xilanase tertinggi setelah A. tubingensis FNCC 6114, namun T. asperellum PK1J2 yang menghasilkan ?-xilosidase yang tertinggi setelah A. tubingensis FNCC 6114. Galur MLT2J2, GAP1, FIG1, MLT5J1, KKB4, dan MLT3J2 menghasilkan ?-xilosidase sebesar 0,021-0,036 U/mL. Sedangkan galur lainnya hanya menghasilkan ?-xilosidase sebesar 0,004-0,016 U/mL. Penambahan 1% glukosa pada xilan medium menurunkan produksi endo-xilanase kurang dari 50% pada galur FNCC 6114, FIG1, GAP1, PK1J2, FNCC 6005 dan MLT4J1. Penurunan lebih dari 95% terjadi pada galur KKB4. Sedangkan galur lainnya terjadi penurunan produksi endo-xilanase dari 63%-84% ketika 1% glukosa ditambahkan dalam medium. Represi yang terjadi pada penambahan 3% glukosa tidak berbeda secara signifikan dengan pengambahan 5% glukosa. Secara umum produksi endo-xilanase sangat rendah saat dilakukan penambahan glukosa dengan konsetrasi 3% atau lebih. Produksi ?-xilosidase pada semua galur juga mengalami represi saat dilakukan penambahan glukosa pada medium xilan. Pada galur FIG1, FNCC 6151, MLT1J1, MLT4J1 dan FNCC 6114, penambahan 1% glukosa pada medium xilan menurunkan produksi ?-xilosidase kurang dari 50%. Sedangkan pada galur KKB4, G2J2, ML3J2 dan MLT4J1, PK1J2, MLT2J2, MLT5J1, GAP1, FNCC 6005, dan FNCC 6012 menurunkan produksi enzim lebih dari 50%. Penambahan 3% glukosa atau lebih juga menurunkan produksi ?-xilosidase pada semua galur yang diuji. Hasil transkriptomik mengidentifikasi 5104 gen downregulated dan 890 gen upregulated. Penambahan glukosa mengakibatkan penurunan regulasi beberapa gen yang terlibat dalam degradasi xilan. Sebagai aktivator, faktor transkripsi XlnR dan AraR menginduksi lebih banyak ekspresi gen pada medium xilan daripada  xilan yang ditambahkan dengan glukosa. Namun, represor CreA dan faktor regulasi lain CreB, CreC dan CreD menunjukkan respon yang beragam. Hasil analisis promoter juga ditemukan adanya sisi pengikatan represor yang dapat menjadi penyebab terjadinya represi katabolit pada galur ini. Hasil analisis transkriptomik mendukung hasil analisis fenotip pada aktivitas xilanase yang mengalami represi katabolit.

Xylanase includes endo-xylanase and ?-xylosidase. Both are produced by different fungi at varying rates. Enzyme production by better microorganisms is required for high yield production. Unfortunately, xylanase production is limited by catabolite repression, which results from the breakdown of xylan polymers and inhibits the production of these enzymes. As a result, increasing xylanase output typically involves removing catabolite repression or increasing the number of genes encoding the enzyme. It is necessary to understand how important repressor-coding genes and other genes associated with catabolite repression function are. It is believed that transcriptomic analysis will give this information, allowing researchers to better understand the incidence of catabolite suppression in fungus. In this work, the ability of several fungi to produce endo-xylanase and ?-xylosidase and their responses to glucose as a repressor were determined. Besides, this research was also conducted to investigate and describe changes in endo-xylanase production, ?-xylosidase production, and gene transcription in fungi after glucose addition. The effect of glucose addition to fungi grown in xylan medium contributes to understanding the mechanism of carbon catabolite repression related to endo-xylanase and ?-xylosidase production. Fourteen fungi were grown in a solid and liquid medium consisting of xylan and xylan supplemented with glucose as the repressor (0, 1%, 3%, and 5%), and the endo-xylanase and ?-xylosidase productions were assayed. Transcriptomic analysis was performed to describe and investigate the changing of gene expression of fungi grown in xylan and xylan containing glucose medium. The RNA of mycelium was extracted and sequenced using next-generation RNA sequencing Illumina NextSeq 550 platform, followed by different expression genes analysis. The results showed that among the 14 strains tested, A. tubingensis FNCC 6114 produced the most endo-xylanase as well as the most ?-xylosidase. However, other strains did not exhibit the same behavior. After A. tubingensis FNCC 6114, A. aculeatus FIG1 generated the greatest endo-xylanase, whereas T. asperellum PK1J2 produced the highest ?-xylosidase. MLT2J2, GAP1, FIG1, MLT5J1, KKB4, and MLT3J2 strains generated ?-xylosidase at concentrations ranging from 0.021 to 0.036 U/mL. The other strains produced just 0.004-0.016 U/mL of ?-xylosidase. In the FNCC 6114, FIG1, GAP1, PK1J2, FNCC 6005, and MLT4J1 lines, adding 1% glucose to the xylan medium reduced endo-xylanase output by less than 50%. The KKB4 line had a reduction of more than 95%. When 1% glucose was introduced to the medium, the other strains reduced endo-xylanase output by 63%–84%. The suppression caused by the addition of 3% glucose was not significantly different from that caused by the administration of 5% glucose. When glucose is supplied at a concentration of 3% or more, the synthesis of endo-xylanase is very low. When glucose was introduced to the growing medium, ?-xylosidase production was suppressed. The addition of 1% glucose to growing media reduced ?-xylosidase production by less than 50% in FIG1, FNCC 6151, MLT1J1, MLT4J1, and FNCC 6114 strains. The addition of 3% glucose or more inhibited ?-xylosidase production in all tested strains. A. tubingensis FNCC 6114 was chosen to be analyzed in transcriptomic analysis. It identified 5104 downregulated and 890 upregulated genes supporting enzymes production above. The addition of glucose resulted in the downregulation of ten genes that were involved in the breakdown of xylan. As activators, the transcription factors XlnR and AraR induced more expression in the xylan medium than in the xylan medium supplemented with glucose. However, repressor CreA and other regulation factors CreB, CreC, and CreD showed various responses. The promoter analysis revealed the presence of a repressor binding site, likely contributing to catabolite repression in this strain. This finding aligns with transcriptomic analysis results, which support phenotypic observations indicating that xylanase activity is subject to catabolite repression.  

Kata Kunci : jamur, endo-xilanase, ?-xilosidase , represi katabolit karbon, sekuensing RNA, transkriptomik