Transformasi Plasmid Rekombinan Pembawa Gen PhaB pada Eschericia coli BL21

BAGAS ALFIAN DWIARYANDA, Ganies Riza Aristya, S.Si., M.Sc., Ph.D.

2024 | Skripsi | BIOLOGI

Polyhydroxybutyrate (PHB) merupakan biopolimer bagian dari anggota Polyhydroxyalkanoates (PHA) yang secara umum diproduksi melalui jalur biosintesis mikrobia. Produksi PHB untuk keperluan industri masih belum ekonomis dibandingkan polimer petroleum. Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan strain penghasil PHB melalui transformasi salah satu gen pengkode jalur biosintesis PHB yaitu gen PhaB pada Escherichia coli BL21. Pada penelitian ini dilakukan transformasi plasmid pUC57-PhaB pembawa gen PhaB pengkode Acetoacetyl-CoA-reductase yang merupakan salah satu katalis dalam jalur biosintesis PHB ke dalam E. coli BL21 menggunakan metode electroporation. Keberhasilan transformasi kemudian diuji dengan pertumbuhan pada medium dengan ampicillin, colony PCR, Sanger sekuensing serta dengan melihat pola pemotongan DNA dengan enzim restriksi SalI dan SbfI. E. coli BL21 berhasil menjadi sel inang tranformasi plasmid rekombinan pUC57-PhaB terkonfirmasi melalui tumbuhnya transforman pada media LB ampicillin. Gen PhaB berhasil teramplifikasi pada 30 koloni tunggal saat dilakukan colony PCR, hasil sekuensing salah satu koloni tunggal menunjukkan identity sebesar 99,85?ngan query coverage 100% terhadap sekuens referensi gen PhaB (KP681583) sebagai kontrol positif, dan whole sequence gen PhaB sebesar 752 bp teramati sebagai pita tunggal dari hasil pemotongan enzim restriksi pada plasmid pUC57-PhaB.

Polyhydroxybutyrate (PHB) is a biopolymer part of the Polyhydroxyalkanoates (PHA) group which is generally produced through microbial biosynthesis. PHB production for industrial purposes is still not economical compared to petroleum polymers. This research aims to develop a PHB-producing strain through transformation of one of the genes encoding the PHB biosynthesis pathway, namely the PhaB gene in Escherichia coli BL21. In this study, transformation of the pUC57-PhaB plasmid carrying the PhaB gene encoding Acetoacetyl-CoA-reductase, which is one of the catalysts in the PHB biosynthesis pathway, was carried out into E. coli BL21 using the electroporation method. The success of the transformation was then tested by grow in medium with ampicillin, colony PCR, Sanger sequencing and by looking at the DNA cutting pattern with the restriction enzymes SalI and SbfI. E. coli BL21 was successful in becoming a host cell for transformation of the pUC57-PhaB recombinant plasmid, confirmed by the growth of the transformant on ampicillin LB medium. The PhaB gene was successfully amplified in 30 single colonies when colony PCR was carried out, the results of sequencing one of the single colonies showed an identity of 99.85% with a query coverage of 100% against the PhaB gene reference sequence (KP681583) as a positive control, and the whole PhaB gene sequence was 752 bp was observed as a single band from the restriction enzyme cut on the pUC57-PhaB plasmid.

Kata Kunci : PhaB, polyhydroxybutyrate, transformasi genetik, E. coli BL21