IN VITRO STUDY OF GSTM1 KNOCKED OUT EFFECT ON ARGINASE-1 (ARG-1) EXPRESSION IN RAW 264.7 MACROPHAGE CELL

Anindya Renata Widyadari Nugroho, dr. Dwi Aris Agung Nugrahaningsih, M.Sc., Ph.D; Dr. dr. Woro Rukmi Pratiwi, M.Kes., Sp.PD

2024 | Skripsi | PENDIDIKAN DOKTER

Genotipe nol Glutathione S-transferase mu 1 (GSTM1) yang memiliki prevalensi tinggi pada populasi dunia, berperan penting untuk mengatur spesies oksigen reaktif (ROS) melalui enzim GSTM1. Hilangnya gen GSTM1 menyebabkan stres oksidatif. Hal ini dapat mengganggu jalur sinyal sel sehingga dapat mempengaruhi pergeseran dinamis antara fenotip makrofag M1 dan M2, dan mengakibatkan proses inflamasi yang berkepanjangan. Kondisi ini dapat berdampak pada ekspresi Arginase-1 (ARG-1), yang merupakan biomarker utama aktivasi M2. Dengan demikian, genotipe nol GSTM1 berpotensi mempengaruhi ekspresi ARG-1 di makrofag. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek genotipe GSTM1 null terhadap ekspresi ARG-1 pada sel makrofag RAW 264.7. Gen GSTM1 di-knockout dari dalam sel RAW 264.7 menggunakan CRISPR-Cas9, mengakibatkan penghapusan gen GSTM1 dari garis sel makrofag RAW 264.7. Data ekspresi mRNA ARG-1 pada makrofag RAW 264.7 diperoleh dengan mengekstraksi dan mengisolasi RNA dari sel RAW264.7, dilanjutkan dengan sintesis cDNA. PCR konvensional dilakukan untuk memperkuat sequence DNA ARG-1 dan GAPDH. Produk PCR yang dihasilkan dipisahkan menjadi fragmen DNA menggunakan elektroforesis, dan pita-pita tersebut divisualisasikan di bawah sinar UV. Data yang diperoleh kemudian dilakukan analisis semi kuantitatif menggunakan ImageJ. Analisis data pada riset ini menggunakan uji T-Independen untuk penilaian statistik. Data yang didapat pada studi ini adalah bahwa dalam sel makrofag RAW 264,7 di mana gen GSTM1 di-knockout, rerata rasio ekspresi mRNA ARG-1 terhadap ekspresi GAPDH adalah 0,517. Sebaliknya, dalam sel dengan gen GSTM1, rerata rasio ekspresi mRNA ARG-1 terhadap ekspresi GAPDH adalah 1,055. Hal ini menunjukkan bahwa sel makrofag RAW 264.7 dengan gen GSTM1 di-knockout memiliki ekspresi mRNA ARG-1 lebih rendah secara signifikan (p = 0.029, p <0>GSTM1-nya tidak ter-knockout. Kesimpulannya, GSTM1 knockout menunjukan adanya efek yang signifikan terhadap ekspresi ARG-1 pada sel makrofag RAW 264.7. Studi ini menunjukkan bahwa tidak adanya gen GSTM1 pada sel makrofag RAW 264.7 dapat menyebabkan ekspresi ARG-1 lebih rendah dibandingkan dengan sel yang memiliki gen GSTM1.

Glutathione S-transferase mu 1 (GSTM1) null genotype, which has a high prevalence in the world population, plays an important role in regulating reactive oxygen species (ROS) through the GSTM1 enzyme. Loss of GSTM1 gene can cause the occurrence of oxidative stress. This can disrupt cell signaling pathways, thereby affecting the dynamic shift between M1 and M2 macrophage phenotypes, and resulting in a prolonged inflammatory process. This condition can impact the expression of Arginase-1 (ARG-1), which is the main biomarker of M2 activation. Thus, the GSTM1 null genotype could potentially affect ARG-1 expression in macrophages. The objective for this research is to investigate the effect of GSTM1 null genotype on ARG-1 expression in RAW 264.7 macrophage cell. The GSTM1 gene was knocked out in RAW 264.7 cells using CRISPR-Cas9, resulting in the deletion of GSTM1 from the RAW 264.7 macrophage cell line. ARG-1 mRNA expression data in RAW 264.7 macrophages were obtained by extracting and isolating RNA from the RAW264.7 cell line, followed by cDNA synthesis. Conventional PCR was performed to amplify the ARG-1 and GAPDH DNA sequences. The resulting PCR products were separated into DNA fragments using electrophoresis, and the bands were visualized under UV light. The obtained data were then subjected to semi-quantitative analysis using ImageJ. The analysis included the use of the Independent-T test for statistical assessment. The data obtained in this study were that in RAW 264.7 macrophage cell where the GSTM1 gene was knocked out, the mean ratio of ARG-1 mRNA to GAPDH expression is 0.517. Conversely, in cell with the GSTM1 gene present, the mean ratio of ARG-1 mRNA to GAPDH expression is 1.055. It shows that in RAW 264.7 macrophage cells with GSTM1 gene knockout, the ARG-1 mRNA expression is significantly lower (p = 0.029, p < 0>GSTM1 gene was not knocked out. Thus, the GSTM1 gene knocked out showed a significant effect on ARG-1 expression in RAW 264.7 macrophage cells. This study demonstrates that the absence of the GSTM1 gene in RAW 264.7 macrophage cells can lead to lower ARG-1 expression compared to cell in which the GSTM1 gene is present.

Kata Kunci : GSTM1, ARG-1, ROS, Oxidative stress, Detoxification, RAW 264.7, CRISPR/Cas9