Effects of GSTM1 Knocked Out on RAW 264.7 Macrophage Cells in MCP-1 mRNA Expression

Luisa Ziesta Dian Apsari, dr. Dwi Aris Agung N., M.Sc., Ph.D; Dr. dr. Woro Rukmi Pratiwi, M.Kes., Sp.PD; dr. Ratih Yuniartha, Ph.D.

2024 | Skripsi | PENDIDIKAN DOKTER

Latar Belakang: Glutathione S-Transferase M1 (GSTM1) merupakan salah satu varian gen Glutathione S-Transferase (GST). GSTM1 penting untuk detoksifikasi stres oksidatif, karsinogen, racun lingkungan, dll. Namun, polimorfisme gen GSTM1 telah dilaporkan, yaitu GSTM1 nol genotipe. Penghapusan ini dapat mempengaruhi fungsi detoksifikasi tubuh. Menurunnya proses detoksifikasi akan menyebabkan peningkatan inflamasi dalam tubuh akibat tingginya Reactive Oxygen Species (ROS). GSTM1 nol genotipe dikaitkan dengan kemungkinan lebih tinggi terkena keganasan, penyakit neurodegeneratif, dll. akibat kegagalan detoksifikasi. Mekanisme GSTM1 nol genotipe dalam mempengaruhi aktivitas makrofag M1 perlu diamati, apakah meningkatkan proliferasi makrofag M1 sebagai makrofag pro-inflamasi atau tidak. MCP-1 akan digunakan sebagai penanda aktivitas makrofag M1.

Tujuan: Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui pengaruh GSTM1 nul genotipe terhadap ekspresi mRNA MCP-1 pada sel makrofag RAW 264.7.

Metode: Gen GSTM1 di-knock out dari sel makrofag RAW 264.7 menggunakan CRISPR-Cas9. Kemudian, ekspresi MCP-1 diperoleh dengan mengekstraksi dan mengisolasi RNA, memproduksi cDNA, dan melakukan PCR konvensional. Intensitas ekspresi mRNA kemudian divisualisasikan menggunakan elektroforesis. Data dianalisis menggunakan ImageJ. Hasil antara sel tipe knock out dan wild type dibandingkan menggunakan uji Independent-T.

Hasil: Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa ekspresi mRNA MCP-1 pada sel makrofag RAW 264.7 knock out GSTM1 memiliki hasil yang lebih rendah jika dibandingkan dengan gen sel makrofag RAW 264.7 normal (wild type) namun tidak bermakna secara statistik (p > 0,05).

Kesimpulan: GSTM1 nul genotipe menunjukkan efek minimal terhadap ekspresi mRNA MCP-1 pada sel makrofag RAW 264.7. Studi ini menunjukkan bahwa tidak ditemukan perbedaan ekspresi MCP-1 pada sel makrofag RAW 264.7 yang GSTM1-nya di-knock out dan yang tidak.

Kata Kunci: Inflamasi; GSTM1; CRISPR-Cas-9; makrofag M1; MCP-1

Background: Glutathione S-Transferase M1 (GSTM1) is one of the variants of Glutathione S-Transferase (GST) gene. GSTM1 is important for detoxification of oxidative stress, carcinogens, environmental toxics, etc. However, polymorphism of GSTM1 gene has been reported, which is GSTM1 null genotype. This deletion may affect the body detoxification function. Decrease of detoxification will lead to higher inflammatory state in the body, due to high Reactive Oxygen Species (ROS). GSTM1 null genotype is connected with higher chance in developing malignancy, neurodegenerative disease, etc. as a result of failure in detoxification. The mechanism of GSTM1 null genotype in affecting macrophage M1 activity should be observed, whether it increase the macrophage M1 proliferation as a proinflammatory macrophage or not. MCP-1 is going to be used as a marker of M1 macrophage activity.

Objective: The aim of this study is to investigate the effect of the GSTM1 knock out on MCP-1 mRNA expression in RAW 264.7 macrophage cells.

Methods: The GSTM1 gene was knocked out from RAW 264.7 macrophage cells using CRISPR-Cas9. Then, the MCP-1 expression was obtained by extracting and isolating RNA, producing cDNA, and performing conventional PCR. The intensity of mRNA expression then was visualized using electrophoresis. The data was analyzed using ImageJ. The result between the knocked out and wild type cells were compared using the Independent-T test.

Result: The results obtained showed that the MCP-1 mRNA expression in GSTM1 knocked out RAW 264.7 macrophage cell has lower results when compared to normal RAW 264.7 macrophage cell (wild type) gene but not significant statistically (p > 0.05).

Conclusion: The GSTM1 null genotype showed minimal effect on MCP-1 mRNA expression in RAW 264.7 macrophage cells. This study showed that there was no difference in MCP-1 expression in RAW 264.7 macrophage cells which GSTM1 was knocked out and those which were not.

Keywords: Inflammation; GSTM1; CRISPR-Cas-9; macrophage M1; MCP-1

Kata Kunci : Inflammation, GSTM1, CRISPR-Cas-9, macrophage M1, MCP-1