Pengembangan metode analisis pentagamavunon-O dalam cairan biologis secara kromatografi cair kinerja tinggi

SYAMSUDIN, Dr. Sudibyo Martono, M.S.,Apt

2003 | Tesis | S2 Ilmu Farmasi

Pentagamavunon-0 atau pgv-0 dengan nama kimia 2,5-bis(4hidroksi-3- metoksi benzilidin)-siklopentanon adalah senyawa yang dikembangkan oleh Tim Molekul Nasional Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada Jogjakarta Indonesia sebagai bahan obat baru yang memiliki efek terapi sebagai anti oksidan, antifungi, antibakteri, penghambatan siklooksigenase, antiinflamasi (Sardjiman, 2000), dan telah dipatenkan di USA dengan nama Pgv-0 (USA Patent No. 09/026,624) dan di Eropa (Nomor 98200519.1). Penelitian selanjutnya terhadap pgv-0 masih perlu dilakukan seperti farmakokinetikanya, untuk itu perlu metode analisis yang mampu mengukur kuantitas pgv-0 atau turunannya dalam cairan biologis. Telah dilakukan pengembangan metode analisis pgv-0 dalam cairan biologis secara kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT), mendasarkan kepada sifat fisika-kimianya. Pgv-0 tidak larut dalam air, larut dalam DMSO, metanol dan beberapa pelarut organik lain, mudah larut dalam alkali dan tidak larut dalam asam, strukturnya mudah dipengaruhi oleh lingkungan pH sehingga memberikan polaritas dan sifat spektroskopi yang berbeda sesuai derajat keasaman dan kebasaan lingkungan pelarutnya. Sistem kromatografi cair kinerja tingi yang dipilih adalah sistem fase terbalik dengan fase gerak metanol:air (70:30, pH=5,95), kolom C18 yang diikatkan pada partikel silika diameter 5 μm dikemas dalam tabung baja tahan karat panjang 125 dengan diameter 4 mm, suhu kolom 25 ºC, kecepatan alir 1 ml per menit diikuti deteksi spektrofotometer uv 270 nm dan vis 420 nm. Dengan parameter demikian pgv-0 memberikan respon puncak di menit 3 sampai dengan 3,8 menit, dengan batas deteksi 1,78 ng/20 μl dan batas kuantitasi 3,85 ng/20 μl, derajat repeatabilitas pada lebih kurang 5 ng/20 μl (n = 5) memiliki simpangan baku relatif (RSD) kurang dari 5%. Metode analisis yang diusulkan mampu memisahkan pgv-0 dari pengotor dan mampu menetapkan kadar vanilin yang masih terkandung dalam pgv-0. Analisis in vitro pada sampel darah, urin feses dan homogenat organ dengan penyari etilasetat:kloroform (1:1), kromatogram menunjukkan respon puncak pgv- 0 terpisah dari matriks sampel sama baiknya pada deteksi di daerah uv 270 maupun visibel di 420 nm. Kromatogram lebih bersih jika deteksi di daerah 420 nm, lebih selektif dibanding deteksi pada 270 nm, namun tidak dapat mendeteksi senyawa dengan kromofor lebih pendek dari pgv-0 seperti vanilin. Lingkup validasi dapat dipenuhi untuk parameter selektifitas, repeatabilitas, presisi, dan akurasi. Struktur pgv-0 yang memiliki 2 buah gugus hidroksil yang terikat di kedua inti bensen dan terdapat atom hidrogen a, menyebabkan mudah terjadinya resonansi elektron dalam lingkungan alkalis, sehingga proses pemisahan pgv-0 sangat bergantung pada kemampuan menjaga kestabilan strukturnya, pemisahan secara kromatografi maupun cara ekstraksi hasilnya sangat tergantung pada lingkungan pH.

Pentagamavunon-0 or pgv-0, 2,5-bis(4hidroxy-3-methoxy benzilidene)- cyclopentanone, had been synthesized and developed by Tim Molekul Nasional Faculty of Pharmacy Gadjah Mada University Jogjakarta Indonesia as an antiinflammatory drugs. Pgv-0 also have anti-oxidative, antifungus, antibacterial, and cyclooxygenase enhancement therapeutical effects (2000, Sardjiman), and had been patented in USA as Pgv-0 or pgv-0 (USA Patent No. 09/026,624) and in Europe (Number 98200519.1). The following research for the pgv-0 must be done especially in pharmacokinetics, thats need an analytical procedure with ability for quantitatifying pgv-0 in between its derivatives (metabolites) in biological fluids. Based on the physical and chemical properties of pgv-0, high performance liquid chromatography (HPLC) methods for qualitative and quantitative analysis of pgv-0 in biological fluids has already been developed. PGV-0 insoluble in water, soluble in DMSO, methanol and some organic solvents, more soluble in alkali and not soluble in acids. The structure of pgv-0 has influenced by pH of solvent, which can bee shown from its spectrum, concordant alkalinity and acidity of solvent environment. The HPLC system thats slelected, is a reversed phase system with methanol:aquadest (70:30, pH=5,95) as a mobile phase, bonded C18 stationary phase bonding on silicas with 5 μm diameters packed on 4 mm diameter 125 mm stainless steel column length, 25 ºC temperature column, 1,0 ml per minute flow rate, in line spectrofotometric detector at 270 and 420 nm. Peak response of pgv-0 has about 3 to 3,8 minute retention time, with detection limit is 1,78 ng/20 μl, and quantitation limit is 3,85 ng/20 μl, their repeatability level at about 5 ng/20 μl have a convidence value or residual standard deviation less than 5% (n =5). Analytical methode that has postulated have a capability to separate pgv-0 from their impurities and capable to quantify vanillin which present in pgv-0 as impurities. In vitro analysis on blood, urine, feaces and homogenized organ samples extracted by ethylacetate:chloroform (1:1), the peak of pgv-0 separated from their matrix exclusively hasn’t difference in the ultra- violet or visible detection. On 420 nm detection the chromatogram was very clear and most selective than detection at 270 nm, but not able to detect substances which has chromophore shorter than pgv-0 chromophore, such as vanillin. Analytical validation of thisa method has covered of the selectivity, repeatability, precission and accuracy. Pgv-0 has two hydroxyl groups in the benzene rings atortho position to methoxy and has a hydrogen atom, thats make it more easy to resonance. This occured in the alkali medium. The separation process on the chromatographic analysis or in the extraction must be done in a constant pH condition to get the optimum result.

Kata Kunci : Obat Anti Inflamasi, PGV,O, Analisis, KCKT, pentagamavunon-0, in vitro, in vivo, KCKT.