Kloning gen gag subunit ca virus penyakit jembrana pada vektor ekspresi eukariot pcDNA 3.1 (+) sebagai calon vaksin DNA

PRANOWO, Deni, Dr. drh. Asmarani Kusumawati, M.P

2003 | Tesis | S2 Bioteknologi

Virus Penyakit Jembrana (JDV) adalah penyebab penyakit yang sangat bebahaya pada sapi Bali (Bos Javanicus). Penyakit Jembrana pertama kali ditemukan di daerah Jembrana, Bali. Genom JDV berupa RNA untai tunggal yang terdiri atas 7.732 nukleotida. Protein CA merupakan salah satu antigen JDV. Pada penelitian ini dilakukan isolasi gen gag subunit ca pengkode protein CA dari genom virus dengan menggunakan metoda RT-PCR satu tahap (single step RT-PCR reaction). Produk RT-PCR langsung di kloning ke dalam plasmid pCR 2.1-TOPO menggunakan kit kloning TOPO-TA. Karakterisasi rekombinan positif, dilakukan dengan pemotongan ganda menggunakan enzim restriksi BamHI-EcoRI. Pada penelitian ini juga dilakukan penyisipan gen gag subunit ca ke dalam plasmid pcDNA 3.1(+), plasmid ekspresi pada sel eukaryot. Gen gag-ca diperoleh dari rekombinan pCR 2.1-CA yang diperoleh dari langkah sebelumnya, dengan pemotongan ganda BamHI-EcoRI. Hasil menunjukkan bahwa 7 dari 7 klon yang diuji semua potitif mengandung DNA sisipan. Dengan demikian efisiensi kloning yang dilakukan adalah 100%.

Jembrana disease virus (JDV) is agent of a highly infectious disease in Bali cattle (Bos javanicus). It disease discovered for the first time in Jembrana district, Bali. JDV genome composed of a single-stranded RNA of 7,732 nucleotides in length has been entirely sequenced. CA protein is an interesting antigen of JDV. This paper described isolation of gag-ca subunit gene of CA protein from the viral genome by a single step RTPCR reaction. RT-PCR products were directly cloned in pCR 2.1-TOPO plasmid by topoisomerase based-TOPO TA cloning kit. A high number of positive recombinant bacterial colonies were obtain which were further analysis by BamHI-EcoRI digestion for a definite characterization of positive clones. The cloning procedure we used is highly efficient enabling rapid and easy gene isolation. In this research also constructed of a pcDNA 3.1 (+)-based vector for DNA vaccine candidate (CA expression in eukaryotic cells). The gag-ca gene was excised from the previous construct pCR 2.1-CA by a digestion with BamHIEcoRI and inserted in pcDNA 3.1 (+) plasmid. 7 out of 7 clones analyzed were positive. Cloning efficiency was thus 100%.

Kata Kunci : Bioteknologi,Vaksin DNA,Virus Penyakit Jembrana, Jembrana disease virus, gag-ca gene, pCR 2.1-CA