Mutasi Terarah Open Reading Frame Luciferase-Like Monooxygenase 2

Melodia Rezadhini, M. Saifur Roman, M. Si., M. Eng., Ph. D.; Ir. Jaka Widada, M. P., Ph. D.; Ahmad Suparmin, S. P., M. AgrSc., Ph. D.

2023 | Skripsi | MIKROBIOLOGI PERTANIAN

Pada penelitian sebelumnya, Open Reading Frame (ORF) Luciferase-like monooxygenase 1 (llm1) dan Luciferase-like monooxygenase 2 (llm2) telah berhasil dikloning dan diekspresikan pada Escherichia coli BL21 (DE3). Analisis solubilitas dari kedua rekombinan protein menyatakan bahwa LLM1 diekspresikan dalam bentuk terlarut, tetapi LLM2 diekspresikan dalam bentuk badan inklusi. Pada penelitian ini, sistem ko-ekspresi dilakukan untuk meningkatkan kelarutan LLM2. Untuk pembuatan sistem tersebut, situs pengenalan  EcoRI  yang ada pada sekuens llm2 perlu  dihilangkan. Dengan melakukan metode mutasi terarah melalui overlap PCR, situs EcoRI telah berhasil dimutasi. Basa kedua timin (T) pada sekuens GAATTC diubah menjadi adenin (A) untuk menghasilkan sekuens GAATAC. Melalui mutasi tersebut, llm2 tidak dapat dipotong oleh EcoRI. Pada penelitian ini, desain sistem ko-ekspresi belum berhasil dilakukan.

In previous research, open reading frame (ORF) Luciferase-like monooxygenase1 (llm1) and Luciferase-like monooxygenase2 (llm2) were successfully cloned and expressed in Escherichia coli BL21 (DE3). Solubility check of both recombinant proteins showed that LLM1 was expressed in soluble form while LLM2 was in inclusion body form. In this work, the co-expression system was employed to enhance the solubility of the LLM2. To implement such system, however, the EcoRI recognition site that presence in llm2 sequence must be removed. By implementing of site directed mutation method by overlapping PCR, the EcoRI site was successfully mutated. The second thymine base of the GAATTC sequence was replaced by adenine (A), to produce GAATAC sequence. By such mutation, the llm2 was resistant to EcoRI digestion. In this work, however the co-expression construction has not succeeded.

Kata Kunci : Mutasi terarah, overlapping PCR, Luciferase-like monooxygenase 2, kloning, ko-ekspresi/ Site-directed mutagenesis, overlapping PCR, Luciferase-like monooxygenase 2, cloning, co-expression.