Ekspresi Gen HBcAg Virus Hepatitis B pada Sel HeLa menggunakan Vektok pEGFP-C1

UMI BAROKAH, Dr. drh. Asmarani Kusumawati, M.P; Dr. drh. Yuli Purwandari Kristianingrum, M.P

2023 | Tesis | MAGISTER BIOTEKNOLOGI

Penyakit hepatitis B merupakan suatu penyakit yang berbahaya, yang disebabkan oleh infeksi virus. Virus hepatitis B (HBV) merupakan virus DNA yang menyebabkan penyakit hepatitis B pada manusia. Vaksin DNA dibuat dengan memasukkan DNA atau gen yang dapat menyandikan protein imunogenik ke dalam vektor ekspresi pada eukariotik. Gen structural HBV yang digunakan sebagai sumber untuk vaksin salah satunya adalah dengan gen HBcAg (subgenotipe HBV/B B3). Tujuan dari penelitian ini adalah mengetahui efektifitas plasmid pEGFP-C1 sebagai vektor ekspresi DNA rekombinan untuk gen HBcAg dan mengetahui ekspresi gen HBcAg virus HBV pada sel HeLa dengan penghantaran Lipofectamine 3000. Penelitian ini diawali dengan kloning molekuler bakteri E. coli DH5α, bakteri E. coli DH5α disiapkan menjadi sel kompeten, selanjutnya plasmid yang mengandung gen HBcAg ditransformasikan pada sel inang E. coli DH5α dengan metode heat shock, kemudian hasil dari transformasi dievaluasi dengan adanya koloni E. coli DH5α pada media agar LB yang mengandung kanamisin, selanjutnya dilakukan isolasi plasmid DNA rekombinan, restriksi plasmid DNA rekombinan, PCR isolasi plasmid DNA rekombinan menggunakan mini prep kit dan maxi prep kit , kemudian dilakukan sekuensing menggunakan layanan jasa PT. Genetika Science. Selanjutnya dilakukan transfeksi pada sel HeLa dengan urutan perlakuan sebagai berikut: 1) Sel Hela tanpa transfeksi (kontrol negatif); 2) Sel HeLa transfeksi dengan plasmid (kontrol negatif); 3) transfeksi menggunakan Lipofectamine 3000 dengan volume gradien 1,9 µl dan 3,8 µl. Selanjutnya dilakukan uji qPCR untuk melihat ekspresi penghantaran Lipofectamine 3000. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa transformasi plasmid pEGFP-C1 yang mengandung gen HBcAg pada bakteri E. coli DH5α berhasil dilakukan, ditandai dengan tumbuhnya koloni bakteri E. coli DH5α pada media LB agar yang mengandung antibiotik kanamisin. Visualisasi pada gel agarosa menunjukkan bahwa plasmid pembawa gen HBcAg dapat ditransformasikan pada sel bakteri E. coli DH5α. Hasil data yang diperoleh dari sekuensing dianalisis menggunakan software ClustalW, kemudian untuk mengetahui ekspresi dari penghantaran Lipofectamine 3000 dilakukan uji qPCR dan hasil yang diperoleh dari Ekspresi gen HBcAg hepatitis B pada sel HeLa dengan penghantaran Lipofectamine 3000 didapatkan hasil pada pengamatan dengan mikroskop konfokal yakni pada perlakuan dengan Lipofectamine 3000 hasil yang didapatkan sel berpendar hijau (fluoresensi) pada perlakuan volume bergradien 1,9 µl dan 3,8 µl sehingga menandakan dapat terekspresi.

Hepatitis B is a dangerous disease, which can be caused by a viral infection. Hepatitis B virus (HBV) is a DNA virus that can cause hepatitis in humans. DNA vaccines are made by inserting DNA or genes that can encode immunogenic proteins into eukaryotic expression vectors. One of the HBV structural genes used as a source for vaccines is the HBcAg gene (HBV/B subgenotype B3). The aims of this study were to determine the effectiveness of the pEGFP-C1 plasmid as a recombinant DNA expression vector for the HBcAg gene and to determine the expression of the HBcAg gene for HBV virus in HeLa cells with Lipofectamine 3000 delivery. This research began with molecular cloning of E. coli DH5α bacteria, E. coli bacteria DH5α was prepared to become competent cells, then the plasmid containing the HBcAg gene was transformed into E. coli DH5α host cells by the heat shock method, then the results of the transformation were evaluated by the presence of E. coli DH5α colonies on LB agar media containing kanamycin, then plasmid DNA was isolated recombinant DNA, restriction plasmid DNA recombinant, PCR isolation of recombinant DNA plasmid using the mini prep kit and maxi prep kit, then sequencing was carried out using the services of PT. Science Genetics. Then transfected HeLa cells with the following treatment order: 1) Hela cells without transfection (negatife control) 2) HeLa cells transfected with plasmid (negatife control) 3 transfections using Lipofectaminee 3000 with a gradient volume of 1.9 µl and 3.8 µl . The qPCR test was then carried out to strengthen the effectiveness of Lipofectamine 3000 delivery. The results of this study indicated that the transformation of the pEGFP-C1 plasmid containing the HBcAg gene to E. coli DH5α bacteria was successfully carried out, marked by the growth of E. coli DH5α colonies on LB agar containing antibiotics. kanamycin. Visualization on the agarose gel showed that the plasmid carrying the HBcAg gene could be transformed into E. coli DH5α bacterial cells. The results of the data obtained from the sequencing were analyzed using ClustalW software, then to determine the expression of Lipofectaminee 3000 delivery a qPCR test was carried out and the results obtained from the expression of the hepatitis B HBcAg gene in HeLa cells with Lipofectaminee 3000 delivery were obtained from observations with a confocal microscope, namely in treatment with Lipofectaminee 3000 the results obtained were green fluorescent cells (fluorescence) in the gradient volume treatment of 1.9 µl and 3.8 µl so that it indicated that it could be expressed.

Kata Kunci : Key: Transformasi, E. coli DH5α, Lipofectamine 3000, Transfeksi, Sel HeLa