Ekspresi Gen rE Virus Dengue pada Sel HeLa menggunakan Vektor pEGFP-N1

NURINA TAHTA AFWI M, Dr. drh. Asmarani Kusumawati, M.P. ; Dr. drh. Sitti Rahmah Umniyati, S.U.

2023 | Tesis | MAGISTER BIOTEKNOLOGI

Virus dengue menyebabkan infeksi Deman Berdarah Dengue (DBD), yang terdiri dari empat serotipe: DENV 1-4. Protein E DENV diketahui sebagai antigen utama yang berperan dalam pengenalan dan pengikatan reseptor agar virus dapat masuk ke dalam sel. Protein multivalen rekombinan E (EDIIIF) yang telah didesain, diketahui mampu bersifat imunogenik protektif untuk dikembangkan sebagai kandidat vaksin. Pengembangan vaksin DNA menggunakan sekuen hasil optimasi protein EDIIIF menjadi strategi menjanjikan dalam pengembangan vaksin DBD. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui apakah gen rE yang dikonstruksi dalam vektor pEGFP-N1 dapat terkloning dalam bakteri E. coli DH5alfa dan mengetahui ekspresi relatif gen rE pada sel HeLa dengan menggunakan Lipofectamine 3000. Penelitian ini dilakukan dengan mengoptimasi kodon EDIIIF untuk dikonstruksi pada pEGFP-N1 dan ditranformasikan dalam E. coli DH5alfa menggunakan MgCl2-CaCl2 dan heatshock. Setelah itu, dilakukan PCR koloni, isolasi plasmid DNA rekombinan, serta verifikasi dengan sekuensing. Isolat DNA rekombinan yang telah terverifikasi digunakan untuk membuat kompleks DNA rekombinan dengan Lipofectamine 3000. Pengamatan fluoresensi dengan mikroskop konfokal pada sel HeLa hasil transfeksi dilakukan. Hasil penelitian menunjukkan bahwa kodon protein EDIIIF yang dioptimasi mengalami peningkatan CAI dari 0,65 menjadi 0,74, membentuk gen recombinant envelope (rE). Gen rE yang dikonstruksi pada vektor pEGFP-N1 tersebut berhasil ditransformasikan pada E. coli DH5alfa, dibuktikan dengan tumbuhnya koloni E. coli pada medium LB agar yang mengandung kanamisin 100 ug/ml, serta adanya single band berukuran 157 bp pada hasil PCR koloni menggunakan primer deteksi gen rE. Berdasarkan visualisasi dari hasil isolasi plasmid bakteri transforman pada gel agarosa 1%, terlihat adanya plasmid dengan konformasi supercoiled, nicked dan linear. PCR menggunakan primer universal pEGFP-N1 membuktikan hasil isolat plasmid mengandung insert gen rE. Analisis pairwise alignment pada hasil sekuensing menunjukkan tidak adanya mutasi pada gen rE, sehingga konformasi protein yang terbentuk sesuai yang diharapkan sebagai kandidat vaksin DNA. Hasil transfeksi pada kultur sel HeLa dengan Lipofectamine menampilkan adanya pendaran hijau EGFP yang teramati pada hasil transfeksi dengan DNA-lipofectamine, dengan hasil fluoresensi pada perlakuan 3,8 ul terlihat lebih jelas dan lebih terang dibandikan dengan perlakuan 1,9 ul. Penelitian ini menunjukkan bahwa gen rE (1449 bp) berhasil diinsersi pada pEGFP-N1 (4633 bp) membentuk DNA rekombinan pEGFP-N1-rE (6180 bp) serta berhasil terkloning menggunakan MgCl2-CaCl2 dan paparan heat shock. Hasil pengamatan menunjukkan gen rE yang telah berfusi dengan egfp berhasil terekspresi pada sel HeLa pada perlakuan dengan transfeksi menggunakan DNA-Lipofectamine.

Dengue virus is known to cause Dengue Hemorrhagic Fever (DHF) infection. It consists of four serotypes: DENV 1-4. The E protein is known as the main antigen of the dengue virus, plays a role in recognition and binding of receptors, so the virus can enter the host cells. The multivalent recombinant E protein (EDIIIF) which has been designed, is known to have protective immunogenic to be developed as a vaccine candidate. The development of a DNA vaccine using the optimized sequence of the EDIIIF protein can be a promising strategy for DHF vaccine development. This study aims to determine whether the rE gene constructed in the pEGFP-N1 vector can be cloned in E. coli DH5alpha bacteria and to determine the relative expression of the rE gene in HeLa cells using Lipofectamine 3000. This research was conducted by optimizing codons from EDIIIF proteins and constructed them on the pEGFP-N1 vector, then transformed into E. coli DH5alpha using MgCl2-CaCl2 and heat shock. After that, colony PCR, isolation of recombinant DNA plasmids, and verification using sequencing were carried out. Verified recombinant DNA isolates were used to prepare DNA-Lipofectamine 3000 complexes. The complexes were transfected into HeLa cells, then fluorescence observation was performed confocal microscopy. The results showed that the optimized codon of EDIIIF protein had an increase in CAI value from 0.65 to 0.74, forming the recombinant envelope (rE) gene. The rE gene was constructed on the pEGFP-N1 vector was successfully transformed into E. coli DH5alpha, as evidenced by the growth of E. coli colonies on LB medium containing 100 ug/ml kanamycin, and the appearance of a single band measuring 157 bp on the colony PCR results using detection primers of rE gene. Based on the visualization results of the plasmid isolation of transformed bacterial on 1% agarose gel, plasmids can be seen in supercoiled, nicked and linear conformations. PCR using the universal primer pEGFP-N1 proved that the plasmid isolate was containing the rE gene insert. Pairwise alignment analysis on the sequencing results showed no mutations in the rE gene, so the conformation of the protein formed was as expected as a DNA vaccine candidate. The results of transfection in HeLa cell cultures with Lipofectamine showed that the green fluorescent was observed in treated HeLa cells with DNA-lipofectamine, where the fluorescent in the 3.8 ul treatment was seen to be more abundant and brighter than the 1.9 ul treatment. This research showed that the rE gene (1449 bp) was successfully inserted on pEGFP-N1 (4633 bp), forming construct pEGFP-N1-rE (6180 bp) and also was successfully cloned using MgCl2-CaCl2 combination and heat shock treatment. The research showed that the rE gene that had fused with egfp was successfully expressed in HeLa cells when transfected with DNA-Lipofectamine.

Kata Kunci : gen rE, Lipofectamine 3000, pEGFP-N1, vaksin DNA, virus dengue