INDUKSI DAN PERKEMBANGAN MIKROSPORA EMBRIOGENIK PADA PADI HITAM TRANSGENIK (Oryza sativa L. �Cempo Ireng�) OVEREKSPRESI OsRKD3

MERI HANDAYANI, Dr. Yekti Asih Purwestri, S.Si., M.Si; Dr. Tri Rini Nuringtyas, S.Si., M.Sc

2023 | Tesis | MAGISTER BIOTEKNOLOGI

Padi hitam (Oryza sativa L.) atau �Cempo Ireng� merupakan tanaman serealia yang berperan sebagai sumber bahan makanan pokok sekaligus sebagai pangan fungsional karena mengandung senyawa antosianin yang bermanfaat bagi kesehatan. �Cempo Ireng� jarang dibudidayakan oleh petani dikarenakan umur panjang dan potensi hasil yang rendah. Usaha pemuliaan �Cempo Ireng� telah dilakukan dengan melakukan overekspresi gen OsRKD3 dan menghasilkan karakter agronomi dengan jumlah tiller, biji, dan cabang malai yang banyak sehingga sesuai untuk seleksi galur murni. Overekspresi gen OsRKD3 juga menyebabkan sel-sel kalus lebih cepat mengalami embriogenesis somatik dan terjadinya upregulasi factor transkripsi OsERF3 dan OsAP2 dibandingkan dengan �Cempo Ireng� wildtype. Penelitian ini melakukan induksi embriogenesis melalui kultur mikrospora untuk mengetahui respon pembentukan embrio somatik serta analisis ekspresi OsERF3 dan OsAP2 pada proses embriogenesis �Cempo Ireng� transgenik overekspresi OsRKD3 (CI OsRKD3) dan �Cempo Ireng� wildtype (CIWT). Studi awal dilakukan untuk mengetahui karakter spikelet dan tiller yang mengandung mikrospora tahap uninukleat akhir-binukleat awal. Induksi embriogenesis mikrospora dilakukan dengan memberi cekaman suhu 4°C pada tiller bunting selama 4-8 hari, mengisolasi antera ke medium cekaman starvasi karbohidrat di medium B pada suhu ±33°C. Shed microcpore bersifat embriogenik di medium B dihitung, diisolasi, dan dikultur ke medium A2 untuk perkembangan lebih lanjut dengan variasi ZPT meliputi NAA, GA, dan TDZ. Analisis ekspresi gen OsERF3 dan OsAP2 dilakukan dengan mengisolasi RNA pada hari ke-0, ke-2, ke-3, dan ke-4 di medium B, sintesis cDNA, dan analisis ekspresi menggunakan qPCR. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa persentase tertinggi mikrospora pada tahapan uninukleat akhir hingga binukleat awal terkandung pada spikelet level 2 baik pada CIWT maupun CI OsRKD3. Spikelet level 2 memiliki karakter kulit lemma dan palea tipis, panjang stamen kurang atau setengah dari panjang spikelet. Tiller yang mengandung spikelet level 2 adalah kelompok tiller 2 yang memiliki ruang kosong lebih dari setengah panjang jarak daun bendera dengan daun kedua. Persentase tertinggi mikrospora embriogenik tipe 3 terdapat pada hari ke-3 inkubasi di medium B sebesar 31% pada CI OsRKD3 dan 18% pada CIWT. Perkembangan mikrospora embriogenik pada medium A2+NAA:GA 1:0,1 ppm didapatkan struktur multiseluler yang masih di dalam eksin (proembrio) dan struktur seperti embrio (ELS) pada CIWT, sedangkan CI OsRKD3 didapatkan mikrokalus berukuran ±1 mm pada medium A2+NAA:GA 1:3 ppm. Akan tetapi, baik ELS dan mikrokalus tersebut tidak menunjukkan perkembangan lebih lanjut dan belum berhasil diregenerasikan menjadi planlet dan tumbuhan utuh. Hasil analisis ekspresi gen menunjukkan bahwa ekspresi gen OsERF3 lebih tinggi dan gen OsAP2 lebih rendah pada CI OsRKD3 dibandingkan pada CIWT.

Black rice (Oryza sativa L.) atau 'Cempo Ireng' is a cereal crop that acts as a source of staple food as well as functional food because it contains anthocyanin compounds that are beneficial for health. 'Cempo Ireng' is rarely cultivated by farmers due to its long life and low yield potential. 'Cempo Ireng' breeding efforts have been carried out by overexpressing the OsRKD3 gene and producing agronomic characters with a large number of tiller, seeds, and panicle branches making it suitable for pure strain selection. Overexpression of OsRKD3 gene also caused callus cells to undergo somatic embryogenesis faster and upregulation of transcription factors OsERF3 and OsAP2 compared to wildtype 'Cempo Ireng'. This study induced embryogenesis through microspore culture to determine the response of somatic embryo formation and analysis of OsERF3 and OsAP2 expression in the embryogenesis process of 'Cempo Ireng' transgenic overexpression of OsRKD3 (CI OsRKD3) and 'Cempo Ireng' wildtype (CIWT). Preliminary studies were conducted to characterize spikelets and tiller containing late uninucleate-early binucleate stage microspores. Induction of microspore embryogenesis was carried out by giving 4°C temperature stress to tiller at the booting stage for 4-8 days, isolating anther to carbohydrate starvation stress medium in medium B at ±33°C. Embryogenic microcpore sheds in medium B were counted, isolated, and cultured to medium A2 for further development with various ZPTs including NAA, GA, and TDZ. Expression analysis of OsERF3 and OsAP2 genes was performed by isolating RNA on days 0, 2, 3, and 4 in medium B, cDNA synthesis, and expression analysis using qPCR. The results showed that the highest percentage of microspores in the late uninucleate to early binucleate stages was contained in level 2 spikelets in both CIWT and CI OsRKD3. Level 2 spikelets are characterized by thin lemma and palea skin, stamen length less than or half of the spikelet length. The tiller containing level 2 spikelets was tiller group 1, which had empty spaces of more than half the length of the distance between the flag leaf and the second leaf. The highest percentage of type 3 embryogenic microspores was found on the 3rd day of incubation in medium B at 31% in CI OsRKD3 and 18% in CIWT. The development of embryogenic microspores in A2+NAA:GA 1:0.1 ppm medium obtained multicellular structures still in the exine (proembryo) and embryo-like structures (ELS) in CIWT, while CI OsRKD3 obtained microcallus measuring ±1 mm in A2+NAA:GA 1:3 ppm medium. However, both ELS and microcallus did not show further development and have not been successfully regenerated into planlets and whole plants. The results of gene expression analysis showed that the expression of OsERF3 gene was higher and OsAP2 gene was lower in CI OsRKD3 than in CIWT.

Kata Kunci : �Cempo Ireng�, embriogenesis, mikrospora, OsAP2, OsERF3, OsRKD3