Upaya Kloning dan Karakterisasi secara In Silico dari Gamma CA Chromohalobacter salexigens BKL5

ASLIKH LANA DINA, M. Saifur Rohman, M.Si, M.Eng., Ph.D.;Dr. Yekti Asih Purwestri, M.Si.

2023 | Tesis | MAGISTER BIOTEKNOLOGI

Carbonic anhydrase (CA) merupakan metaloenzim yang mengkatalis CO2 menjadi bikarbonat secara reversible. Carbonic anhydrase dapat digolongkan dalam 7 tipe yaitu alfa, beta, gamma, delta, eta, zeta, dan teta. Carbonic anhydrase tersebar luas di tiga Domain kehidupan. Pada bakteri, dapat ditemukan alfa, beta, dan gamma CA. Penelitian terkait gamma CA sangat terbatas. Pada penelitian ini, dipilih gamma CA dari bakteri yaitu gamma CA dari C. salexigens BKL5 yang merupakan bakteri halofil moderat dari Bledug Kuwu, Desa Kuwu, Jawa Tengah serta diketahui memiliki beta dan gamma CA. Mempelajari gamma CA dari C. salexigens BKL5 dapat membantu memahami aspek adaptasi C. salexigens BKL5 pada lingkungan dengan kadar garam tinggi dan prediksi keberadaan residu yang berperan dalam aktivitas katalitik apabila dibandingkan dengan protein homolognya. Pada penelitian ini analisis dilakukan dengan mencob amenghasilkan plasmid rekombinan pET28a-gamma CA, analisis pada sekuens asam aminonya baik secara filogenetik maupun berdasarkan komposisi asam aminonya, pemodelan struktur 3D, analisis electrostatic surface potential, analisis berdasarkan permukaan hidrofobiknya, dan superposisi dengan struktur Cam. Pada penelitian ini dapat diasumsikan gamma CA C. salexigens BKL5 tidak tergolong sebagai protein halofil, tetapi mengandung asam amino bermuatan negatif yang lebih tinggi dibandingkan dengan gamma CA dari bakteri non-halofil dan mengandung residu hydrofobik (alanin dan valin) yang lebih tinggi dibandingkan dengan gamma CA dari bakteri non-halofil. Residu penting terkait aktivitas katalitik gamma CA yaitu Glu62, Glu84, dan Asn202 tidak ditemukan pada gamma CA C. salexigens BKL5 mengisyaratkan bahwa kemungkinan enzim tersebut tidak memiliki aktivitas katalitik. Pada upaya dilakukan kloning pada vector pET28a belum berhasil dan diduga sisi NdeI tidak dapat terdigesti dengan optimal sehingga tidak dapat dilakukan ligasi dengan optimal. Pada beberapa penelitian lain, gamma CA yang tidak menunjukkan aktivitas katalitik memiliki peran lain dalam mendukung pertumbuhan dan survival bakteri.

Carbonic anhydrase (CA) is metalloenzyme which catalyze CO2 into bicarbonic acid reversibly. There are 7 type of Carbonic anhydrase alpha, beta, gamma, delta, zeta, eta, and theta. Carbonic anhydrase is widespread in 3 Domain of life. Bacteria can have alpha, beta, dan gamma CA, but research about gamma CA is very limited. In this study, gamma CA C. salexigens BKL5 from Bledug Kuwu is selected to be characterized. Research about gamma CA from C. salexigens BKL5 can help us to understand haloadaptation of C. salexigens BKL5 and predict the amino acid residues that involved in catalytic activity based on its homolog (Cam). This study is done by built construct ET28a-gamma CA, analyzed the amino acid sequence, 3D structure, electrostatic surface potential, hydrophobic surface, and superposition. The construct of pET28a-gamma CA BKL5 is not obtained yet. This study show that gamma CA C. salexigens BKL5 is not halophilic protein but show higher acidic proteome and higher hydrophobic residue (valine and alanine) in interface area rather than gamma CA from non-halophilic bacteria. The residues that crucial in catalytic activity (Glu62, Glu84, Asn202) of Cam do not found in gamma CA C. salexigens BKL5, indicated that gamma CA C. salexigens BKL5 is predicted do not have catalytic activity to hydrate CO2 into bicarbonic acid. Provide recombinant of gamma CA C. salexigens using pET28a, did not show the result because the NdeI site can not be digested and ligated well.In some researchs, gamma CA is predicted do not has catalytic activity but has another role in cell to support bacterial survival.

Kata Kunci : Bikarbonat, Chromohalobacter salexigens, Gamma carbonic anhydrase