COMPARISON OF HIGH AND ULTRA-HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY FOR DETERMINATION OF PHENOLIC COMPOUNDS IN CHRYSANTHEMUM TEA: METHOD DEVELOPMENT AND VALIDATION

SITTI RAHMAWATI, Dr. Widiastuti Setyaningsih, S.T.P., M.Sc. ; Prof. Miguel Palma Lovillo

2022 | Tesis | MAGISTER ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN

Senyawa fenolat telah ditemukan pada bunga yang dapat dimakan, termasuk bunga krisan (Chrysanthemum morifolium Ramat). Bunganya biasa dikonsumsi sebagai teh dalam bentuk kering. Untuk menentukan kadar senyawa fenolik dalam teh bunga krisan, metode baru telah ditetapkan menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi dengan detektor Diode Array (HPLC-DAD) dan Kromatografi Cair Kinerja Ultra Tinggi dengan detektor Photo Diode Array (UPLC-PDA). Desain Box-Behnken digunakan untuk mengevaluasi pengaruh variabel kerja, seperti elusi gradien dan laju aliran. Komposisi optimum fase gerak (A, asam asetat 0,1% dalam air; dan B, asam asetat 2% dalam asetonitril). Titik optimal untuk HPLC-DAD digunakan pada awal (2,5% fase B) dan akhir (94% fase B) dari program gradien dengan laju alir 1 mL/min. Sementara itu, titik optimum untuk UPLC-PDA digunakan pada awal (0% fase B) dan akhir (55% fase B) program gradien dengan laju alir 0,47 mL/min. Hasil mengungkapkan total waktu analisis sepuluh senyawa fenolik (asam galat, asam protokatekuat, asam klorogenat, asam p-hidroksibenzoat, katekin, asam kafeat, asam vanilat, asam p-koumarat, asam ferulat, dan kuersetin) yang ditemukan di krisan kering di kurang dari 13 menit untuk HPLC-DAD sedangkan untuk UPLC-PDA kurang dari 6 menit tanpa gangguan. Selanjutnya, parameter validasi dinilai untuk penentuan senyawa fenolik dalam rentang linier 1 hingga 12,5 mg/L (R2 = 0,999) dan 15 hingga 125 mg/L (R2 = 0,999) untuk HPLC-DAD dan uji linier, rentang 1 hingga 7,5 mg/L (R2 = 0,999) dan 15 hingga 40 mg/L (R2 = 0,999) untuk UPLC-PDA. Batas identifikasi dan kuantifikasi tertinggi dicatat dalam asam galat (masing-masing 0,99 dan 3,25 mg/L), sedangkan yang terendah adalah untuk kuersetin (masing-masing 0,41 dan 1,36 mg/L) untuk HPLC-DAD dan untuk UPLC-PDA, identifikasi tertinggi dan batas kuantifikasi dicatat dalam katekin (masing-masing 0,17 dan 0,53 mg/L), sedangkan yang terendah adalah untuk kuersetin (masing-masing 0,09 dan 0,28 mg/L). Koefisien variasi (%CV) presisi intra dan antar hari kurang dari 3% untuk HPLC-DAD dan kurang dari 2% untuk UPLC-PDA untuk variabilitas waktu retensi dan luas puncak. Selanjutnya, pemulihan berkisar antara 93,2 (asam protokatekuat) hingga 104,8% untuk HPLC-DAD, sedangkan pemulihan berkisar antara 92,1 (asam p-koumarik) hingga 107,5% (asam klorogenat) untuk UPLC-PDA. Temuan ini menunjukkan bahwa metode yang dikembangkan dapat diandalkan untuk menentukan senyawa fenolat yang dipelajari dalam teh krisan.

Phenolic compounds have been discovered in edible flowers, including chrysanthemum (Chrysanthemum morifolium Ramat). The flowers are usually consumed as tea in dried form. To determine the level of phenolic compounds in chrysanthemum tea, a new method have been established using high-performance liquid chromatography in couple with diode array detection (HPLC-DAD) and ultra-high-performance liquid chromatography in combination with photodiode array detection (UPLC-PDA). The Box-Behnken design was employed to evaluate the effect of working variables, such as gradient elution and flow rate. The optimum composition of mobile phase (A, 0.1% acetic acid in water; and B, 2% acetic acid in acetonitrile). The optimum point for HPLC-DAD was used in the beginning (2.5% of phase B) and final (94% of phase B) of the gradient program with a flow rate 1 mL min-1. Meanwhile, the optimum point for UPLC-PDA was used in the beginning (0% of phase B) and final (55% of phase B) of the gradient program with a flow rate 0.47 mL min-1. The results disclosed a total analysis time of ten phenolic compounds (gallic acid, protocatechuic acid, chlorogenic acid, p-hydroxybenzoic acid, catechin, caffeic acid, vanillic acid, p-coumaric acid, ferulic acid, and quercetin) found in dried chrysanthemum in less than 13 min for HPLC-DAD whereas for UPLC-PDA in less than 6 min without interferences. Furthermore, the validation parameters were assessed for the determination of phenolic compounds within the linear ranges of 1 to 12.5 mg L-1 (R2 = 0.999) and 15 to 125 mg L-1 (R2 = 0.999) for HPLC-DAD and the linear ranges of 1 to 7.5 mg L-1 (R2 = 0.999) and 15 to 40 mg L-1 (R2=0.999) for UPLC-PDA. The highest identifications and quantification limits were noted in gallic acid (0.99 and 3.25 mg L-1, respectively), whereas the lowest was for quercetin (0.41 and 1.36 mg L-1, respectively) for HPLC-DAD and for UPLC-PDA the highest identifications and quantification limits were noted in catechin (0.17 and 0.53 mg L-1, respectively), whereas the lowest was for quercetin (0.09 and 0.28 mg L-1, respectively). The coefficient of variation (%CV) of intra- and inter-day precision were less than 3% for HPLC-DAD and less than 2% for UPLC-PDA for variability in retention time and area of peaks. Furthermore, the recoveries ranged from 93.2 (protocatechuic acid) to 104.8% for HPLC-DAD, whereas the recoveries ranged from 92.1 (p-coumaric acid) to 107.5% (chlorogenic acid) for UPLC-PDA. These findings indicated that the developed methods were reliable for determining the studied phenolic compounds in chrysanthemum tea.

Kata Kunci : Box-Behnken design, dried edible flowers, separation, floral tea, HPLC-DAD, UPLC-PDA.