IDENTIFIKASI PEPTIDA SPESIFIK GELATIN BABI DAN APLIKASINYA UNTUK ANALISIS GELATIN BABI DENGAN METODE LIQUID CHROMATOGRAPHY MASS-SPECTROMETRY (LC-MS) DENGAN MODE MULTIPLE REACTION MONITORING (MRM)

FITRIANA MAHARJANTI, Tri Joko Raharjo, S.Si., M.Si., Ph.D.; Respati Tri Swasono, M.Phil., Ph.D.

2022 | Tesis | MAGISTER KIMIA

Gelatin merupakan hasil hidrolisis parsial protein kolagen yang banyak digunakan pada industri makanan dan obat. Sumber utama gelatin dapat berasal dari kulit dan tulang hewan seperti babi, sapi, kambing maupun ikan. Hal ini menjadikan makanan yang mengandung gelatin rawan mengandung komponen non halal. Metode polymerase chain reaction (PCR) menjadi metode utama dalam identifikasi komponen non halal berdasarkan keberadaan DNA spesies non halal. Tidak adanya kandungan DNA dalam gelatin menyebabkan identifikasi gelatin babi dengan PCR kurang akurat. Penelitian ini bertujuan mengembangkan metode identifikasi gelatin babi menggunakan liquid chromatography mass-spectrometry (LCMS) dengan mode multiple reaction monitoring (MRM) sebagai alternatif metode non-PCR. Identifikasi peptida spesifik gelatin babi dilakukan secara in silico dikombinasi dengan analisis bioinformatika data HRMS gelatin babi. Peptida spesifik babi yang teridentifikasi diseleksi berdasarkan kriteria peptida yang sesuai untuk analisis MRM dan kemudian peptida dengan berat molekul < 1000 Da disintesis. Peptida sintesis digunakan untuk optimasi kondisi LC-MS mode MRM. Metode yang dikembangkan divalidasi untuk spesisitas, akurasi, presisi, range linier, batas deteksi, batas kuantifikasi dan diaplikasikan untuk autentikasi gelatin babi. Teridentifikasi tujuh peptida spesifik gelatin babi dengan tiga diantaranya memenuhi kriteria peptida yang sesuai untuk analisis MRM. Peptida dengan urutan asam amino GPPGSAGAPGK (berat molekul = 895 Da) dipilih untuk disintesis Hasil optimasi LC-MS didapatkan kondisi capillary voltage, cone voltage dan collision energy masing-masing sebesar 2,5 kV; 25 eV dan 1,7 eV, dengan transisi MRM (M+2H)2+ (m/z = 448 Da) menjadi ion y9+ (m/z = 741 Da) menghasilkan hasil terbaik untuk analisis. Validasi metode dari ion y9+ menunjukkan spesifitas terhadap gelatin babi, dengan koefisien korelasi (r) = 0,997, perolehan kembali 100,71%�109,74% dengan nilai RSD adalah 10,97%, batas deteksi 0,1551 mg/L dan batas kuantifikasi 0,5169 mg/L. Hasil autentikasi sampel gelatin komersial menunjukkan 3 sampel gelatin komersial menghasilkan puncak kromatogram untuk ion y9+. Metode yang dikembangkan pada penelitiaan ini dapat digunakan untuk analisis rutin identifikasi gelatin babi.

Gelatin results from the partial hydrolysis of collagen proteins are widely used in the food and drug industry. The main source of gelatin can come from the skin and bones of animals such as pigs, cows, goats, or fish, which makes gelatin foods vulnerable to non-halal components. The polymerase chain reaction (PCR) method is the main method of identifying non-halal components based on the DNA of non-halal species. However, the absence of DNA content in gelatin leads to less accurate identification of porcine gelatin with PCR. This study aims to develop the porcine gelatin identification method using liquid chromatography-mass spectrometry (LCMS) with multiple reaction monitoring (MRM) mode as an alternative to the non-PCR method. Identification of porcine gelatin-specific peptides was performed using in silico analysis combined with bioinformatics analysis of HRMS data of porcine gelatin. The identified porcine-specific peptides were selected based on the appropriate peptide criteria for MRM analysis, and then peptides with a molecular weight of < 1000 Da were synthesized. The synthetic peptide was used for the optimization of MRM mode LC-MS conditions. The developed method was validated for specificity, accuracy, precision, linear range, detection limit, and quantification limit and applied for porcine gelatin authentication. Seven specific peptides of porcine gelatin were identified, and three among them met the criteria to be used for MRM analysis. Peptides with the amino acid sequence GPPGSAGAPGK (molecular weight = 895 Da) were selected for synthesis. The results of LC-MS optimization obtained capillary voltage, cone voltage and collision energy conditions of 2.5 kV; 25 eV and 1.7 eV, respectively, with the transition of MRM (M +2H)2+ (m/z = 448 Da) being y9+ ions (m/z = 741 Da) give the best results for analysis. Validation of the method from ion y9+ showed specificity to porcine gelatin, with a correlation coefficient (r) = 0.997, a regain of 100.71% - 109.74% with an RSD value of 10.97%, a detection limit of 0.1551 mg/L and a quantification limit of 0.5169 mg/L. Results of authentication of commercial gelatin samples showed 3 commercial gelatin samples produced chromatogram peaks for ion y9+. The methods developed in this study can be used for routine analysis of porcine gelatin identification.

Kata Kunci : biomarker, gelatin, lcmsms, mrm, peptida