Karakterisasi molekular bakteri endofit pada tebu (Saccharum officinarum, L.)

PURWESTRI, Yekti Asih, Ir. Triwibowo Yuwono, PhD

2003 | Tesis | S2 Bioteknologi

Bakteri endofit diketahui mempunyai peranan penting dalam menunjang vitalitas tanaman. Bakteri endofit tersebut berperan untuk menambat nitrogen, menghasilkan fitohormon, membantu proses fotosintesis, pengendali hayati dan meningkatkan kemampuan tanaman untuk mendegradasi kontaminan di rhizosfer. Penemuanpenemuan baru bakteri endofit pada beberapa tanaman menunjukkan bahwa masih banyak spesies yang belum dideskripsikan. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengkarakterisasi bakteri endofit hasil isolasi dari batang tebu varietas PS-851 dari kebun P3GI, Pasuruan Jawa Timur dengan cara sidikjari DNA. Penerapan metoda biologi molekular dalam penelitian ini diharapkan dapat mengungkapkan keanekaragaman bakteri endofit yang terdapat pada batang tebu. DNA genom lima isolat bakteri endofit dari batang tebu dan dua strain acuan Azorhizophilus paspali DSM 2283T serta Azotobacter chroococcum DSM 2286T diisolasi. Oligonukleotida yang komplementer terhadap daerah yang bersifat lestari pada DNA yang mengkode 16S rRNA (rDNA) bakteri digunakan untuk amplifikasi dengan metode PCR. Produk PCR 16S rDNA kemudian dikarakterisasi dengan restriction fragment length polymorphism analysis yang disebut dengan metode ARDRA (amplified rDNA restriction analysis). Pola ARDRA selanjutnya dianalisis secara sistematik numerik dengan menggunakan program MVSP versi 2.0. Similaritas diantara isolat-isolat dihitung dengan menggunakan koefisien simple matching. Analisis klaster dilakukan dengan algoritma UPGMA. Hasil pemotongan dengan enzim endonuklease restriksi AluI dan Hinf I menunjukkan bahwa ada tiga isolat yang mempunyai pola ARDRA sama, yaitu NB 112, 10.3.1 dan 10.3.3. Sedangkan pemotongan dengan enzim endonuklease restriksi RsaI ada dua isolat, yaitu NB 112 dan 10.3.1 menunjukkan pola ARDRA yang sama. Penggunaan ketiga macam enzim ini menunjukkan bahwa isolat NB 112, 10.3.1 dan 10.3.3 berada dalam satu kelompok dengan strain acuan Azorhizophilus paspali DSM 2283T.Pemotongan dengan enzim endonuklease HinfI menunjukkan bahwa isolat NB 111 dan 5LGI terletak satu kelompok dengan strain acuan Azotobacter chroococcum DSM 2286T, walaupun isolat-isolat ini mempunyai kemiripan rendah dengan indeks similaritas 43,8%. Amplikon 16S rDNA isolat 5 LGI menunjukkan hasil yang berbeda pada pemotongan dengan enzim endonuklease restriksi AluI. Isolat 5 LGI mempunyai kemiripan tinggi dengan strain acuan Azorhizophilus paspali DSM 2283T dan terletak dalam satu kelompok dengan isolat NB 112, 10.3.1 dan 10.3.3. Ketepatan pembedaan pola ARDRA amplikon 16S rDNA ini tergantung pada jenis dan jumlah enzim restriksi yang digunakan. Pada penelitian ini, penggunaan enzim RsaI menunjukkan hasil yang kongruen dengan uji biokimiawi dan morfologis awal yang dilakukan dalam membedakan kelima isolat bakteri endofit dan strain acuan.

Several endophytic bacteria have been known to play important roles in plant vitality. These bacteria may benefit their host plants as nitrogen fixing bacteria, phytohormone production, photosynthesis, biocontrol and biodegradation contaminant in the rhizosphere.. These findings suggest that other endophytic bacteria may not yet have been described. The objective of this study is to characterize the endophytic bacteria isolated from stems of sugarcane varietas PS-851 from P3GI field, Pasuruan, East-Java by DNA fingerprinting. The application of molecular analysis has greatly fasilitated to reveal biodiversity of bacterial endophyte. Genomic DNA of five strains of endophytic bacteria isolates and two type strains Azorhizophilus paspali DSM 2283T and Azotobacter chroococcum DSM 2286T were isolated. Oligonucleotides complementary to conserved regions in 16S rRNA-encoding DNA (rDNA) of bacteria were used for PCR amplification. The 16S rDNA PCR products were characterized by restriction fragment length analysis termed ARDRA (amplified rDNA restriction analysis). ARDRA patterns were analyzed by using the MVSP version 2.0. to determine the similarities between the test strains using the simple matching coefficient. Cluster analysis were performed by the unweighted pair group method with arithmetic means (UPGMA). Restriction analysis with endonucleases AluI and HinfI showed that isolates NB 112, 10.3.1 and 10.3.3 had an identical ARDRA pattern. However, restriction analysis with endonucleases RsaI revealed that isolates 10.3.1 and 10.3.3 had the similar ARDRA pattern. Moreover, restriction analysis with endonucleases AluI, HinfI and RsaI showed that isolates NB 112, 10.3.1 and 10.3.3 were clustered with the Azorhizophilus paspali DSM 2283T type strain. Isolates NB 111 and 5LGI were clustered with the Azotobacter chroococcum DSM 2286T type strain by the digestion of the endonuclease HinfI. The different result was represented by the restriction analysis with endonuclease AluI. Isolate 5LGI closely related with Azorhizophilus paspali DSM 2283T type strain and was clustered with isolates NB 112, 10.3.1 and 10.3.3, respectively. In conclusion, the accuracy of distinction between different 16S rDNA fragments by ARDRA depends on the number and the type of restriction endonuclease enzymes used. This research show that digestion with endonuclease RsaI provides a congruence result with the biochemical and morphological preliminary characterization.

Kata Kunci : Bioteknologi, Bakteri Endofit, Karakterisasi, Batang Tebu Varietas PS, 851ARDRA, enzim endonuklease restriksi.