PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI ALFA-AMILASE TERMOSTABIL ISOLAT Geobacillus sp. DS3 DARI KAWAH SIKIDANG, DATARAN TINGGI DIENG, JAWA TENGAH, INDONESIA

DEA RIZKI WIDIANA, Dr. rer. nat. Lucia Dhiantika Witasari, S.Farm., Apt., M.Biotech.; Dr. nat. tech. Andriati Ningrum, S.T.P., M.Agr.

2022 | Tesis | MAGISTER ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN

Alfa-amilase merupakan enzim yang mampu menghidrolisis polisakarida menjadi sakarida sederhana seperti glukosa, maltosa, dan dekstrin. Pengaplikasian enzim alfa-amilase telah dilakukan secara luas pada berbagai industri, termasuk industri pangan pada pembuatan gula pada proses liquifikasi dan pembuatan roti. Proses tersebut membutuhkan kondisi suhu yang tinggi, sehingga enzim alfa-amilase yang diperlukan berupa enzim yang memiliki ketahanan pada suhu yang tinggi. Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa isolat Geobacillus sp. DS3 dari Kawah Sikidang, Dataran Tinggi Dieng, menunjukkan adanya aktivitas amilase pada media pati cair pada suhu 70 °C. Tujuan penelitian ini adalah untuk melakukan pemurnian dan melakukan karakterisasi alfa-amilase termostabil dari isolat Geobacillus sp. DS3. Enzim alfa-amilase dari isolat Geobacillus sp. DS3 diproduksi pada media pati cair untuk diperoleh kondisi waktu dan suhu optimum inkubasi. Ekstrak kasar yang diperoleh dari produksi tersebut selanjutnya dimurnikan dengan metode pengendapan amonium sulfat dan kolom DEAE Sephadex A-25. Enzim parsial murni dikarakterisasi berat molekul dengan metode SDS-PAGE, suhu dan pH optimum, pengaruh kofaktor dan inhibitor. Enzim murni dianalisis nilai Km dan Vmax dengan persamaan Lineweaver Burk. Aktivitas enzim dianalisis dengan menggunakan metode 3,5-asam dinitrosalisilat (DNS) dan kadar protein dengan metode Bradford. Hasil penelitian menunjukkan bahwa Geobacillus sp. DS3 mampu memproduksi enzim alfa-amilase secara optimal pada suhu 60 °C selama 15 jam. Ekstrak kasar menunjukkan aktivitas tertinggi pada saturasi amonium sulfat 40-60%. Berat molekul enzim diprediksi berukuran 58 kDa. Alfa-amilase termostabil menunjukkan aktivitas optimum pada suhu 50 °C pada buffer fosfat pH 7,0. Penambahan garam CaCl2 dan KCl menunjukkan adanya peningkatan aktivitas sehingga diduga bersifat sebagai kofaktor. Aktivitas alfa-amilase termostabil dihambat oleh inhibitor EDTA, PMSF, 2-merkaptoetanol, dan HgCl2. Nilai Km dan Vmax dari enzim murni adalah sebesar 235,43 mM dan 1.428,57 U/mL. Enzim alfa-amilase termostabil berpotensi digunakan pada industri pembuatan roti.

Alpha-amylase is an enzyme which can hydrolyze polysaccharide to simple saccharide such as glucose, maltose, and dextrin. The application of alpha-amylase has been used in various industry including food industry in sugar production in the liquefation process. The process requires high temperature, so the alpha-amylase which resistant at high temperature is needed. In the previous study, Geobacillus sp. DS3 isolated from Sikidang Crater, Dieng Plateu, showed amylase activity in starch medium at 70 °C. This study aimed to purify and characterize the thermostable alpha-amylase from Geobacillus sp. DS3. Alpha-amylase from Geobacillus sp. DS3 produced in starch liquid medium to obtain the optimum condition of incubation. The crude extract then purified using ammonium sulfate precipitation and column DEAE-Sephadex A-25. The partial purified enzyme was characterized using SDS-PAGE to obtain molecular weight, temperature and pH optimum, and the cofactors and inhibitors. Purified enzyme then analyzed the Km and Vmax using Lineweaver-Burk equation. The enzyme activity was determined using the 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) method and the protein concentration using Bradford method. The results showed that Geobacillus sp. DS3 optimally produced the alpha-amylase at 60 °C for 15 h. The alpha-amylase showed good activity at saturation of ammonium sulfate 40-60%. The molecular weight of the enzyme was estimated to be 58 kDa. Thermostable alpha-amylase showed activity at the optimum temperature at 50 °C in sodium phosphate buffer pH 7.0. The addition of CaCl2 and KCl showed an increase in enzyme activity so that expected to be as cofactors. The thermostable alpha-amylase activity was inhibited by EDTA, PMSF, 2-mercaptoethanol, and HgCl2. The Km and Vmax of the pure enzyme were 235.43 mM and 1428.57 U/mL, respectively. The thermostable alpha-amylase had potential to be used in bakery industry.

Kata Kunci : alfa-amilase, alfa-amilase termostabil, Geobacillus sp. DS3, termostabil, purifikasi