KLONING DAN EKSPRESI GEN OPEN READING FRAME LUCIFERASE-LIKE ENZYME TIPE-1 DARI BAKTERI Priestia megaterium PSA14

HANNA KRISTIAN PUTRI, M. Saifur Rohman, M.Si., M.Eng., Ph.D.; Nur Akbar Arrofatullah, S.P., M.Biotech., Ph.D

2021 | Skripsi | S1 MIKROBIOLOGI PERTANIAN

Luciferase-like monooxygenase (LLM) merupakan enzim FMN-dependen monooksigenase yang memiliki kemampuan untuk mengkatalisis reaksi oksidasi Baeyer-Villiger. Aktivitas oksidasi tersebut memiliki peranan penting dalam proses biosintesis berbagai jenis senyawa organik serta degradasi senyawa xenobiotik. Hasil analisis insilico mengindikasi bahwa genom Priestia megaterium PSA14 memiliki empat open reading frames (ORFs) LLM yang belum diketahui fungsinya. Tujuan dari penelitian ini ialah untuk melakukan isolasi, kloning, serta ekspresi protein ORF LLM Luc1 dari genom Priestia megaterium PSA 14 pada Escherichia coli BL21 yang diinduksi dengan (isopropyl beta-D-1 thiogalactopyranoside) IPTG. Isolasi ORF LLM Luc1 dengan ukuran 1064 bp dilakukan dengan amplifikasi menggunakan PCRdan dikloning ke dalam vektor ekspresi pET28a(+) dengan ukuran 3569 bp yang dipotong menggunakan enzim restriksi NcoI dan EcoRI secara double digest. Ligasi ORF Luc1 dilakukan dengan T4 DNA Ligase, kemudian hasil ligasi ditransformasi ke dalam sel kompeten Escherichia coli BL21(DE3). Ekspresi dari DNA rekombinan Luc1 pada Escherichia coli BL21(DE3) diinduksi oleh IPTG dan dianalisis dengan 12% SDS-PAGE. Melalui penelitian ini, diperoleh hasil bahwa ORF Luc1 berhasil dikloning dan diekspresikan pada Escherichia coli BL21(DE3) dengan berat molekul sebesar 33 kDa.

Luciferase-like monooxygenase (LLM) is an FMN-dependent monooxygenase enzyme that has the ability to catalyze Baeyer-Villiger oxidation reaction. This oxidation activity has an important role in the biosynthesis of various types of organic compounds and the degradation of xenobiotic compounds. The results of in-silico analysis indicate that Priestia megaterium PSA14 genome has four LLM open reading frames (ORFs) with unknown functions. The objective of this work was to isolate, clone, and overexpress the ORF LLM Luc1 protein from the Priestia megaterium PSA 14 genome in Escherichia coli BL21 induced by isopropyl beta-D-1 thiogalactopyranoside (IPTG). Isolation of ORF LLM Luc1 with a base length of 1064 bp was carried out by amplification using PCR and cloned into pET28a(+) expression vector with a size of 3569 bp, which was cut using restriction enzymes NcoI and EcoRI by double digest method. ORF Luc1 ligation was performed with T4 DNA Ligase, then the ligation results were transformed into Escherichia coliBL21(DE3) competent cells. Overexpression of Luc1 recombinant DNA in Escherichia coli BL21(DE3) is induced by IPTG and analyzed by 12% SDS-PAGE. Through this study, it was found that ORF Luc1 was successfully cloned and expressed in Escherichia coli BL21(DE3) with a molecular weight of 33 kDa

Kata Kunci : Priestia megaterium PSA14, LLM Luc1, oksidasi Baeyer-Villiger.