Pengembangan Metode Real-Time Polymerase Chain Reaction Untuk Analisis Dna Babi Dan Sapi Dalam Bakso Untuk Autentikasi Halal

SALMAH ORBAYINAH, Prof.Dr.apt.Sismindari,S.U.; Prof.Dr.apt.Abdul Rohman,M.Si.; Dr.rer.nat. pt.Adam Hermawan, M.Sc.

2021 | Disertasi | DOKTOR ILMU FARMASI

Seiring dengan telah diberlakukannya Undang-Undang Jaminan Produk Halal (UU-JPH) No. 33 Tahun 2014 maka produk makanan yang beredar di Indonesia harus dijamin kehalalannya. Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan metode Real-Time Polymerase Chain Reaction menggunakan primer spesifik spesies, probe TaqMan dan multiplex untuk mendeteksi kontaminasi daging babi dalam produk bakso sapi menggunakan primers dan probe baru yang telah dirancang. Tahapan penelitian terdiri atas uji kinerja metode RT-PCR menggunakan primer spesifik spesies, probe TaqMan dan multiplex pada bakso yang meliputi uji spesifisitas, batas deteksi dan efisiensi, sensitivitas dan repeatability. Hasil uji metode menggunakan primer spesifik spesies menunjukkan bahwa primers yang dirancang yaitu primers cyt b (A) dan D-Loop (B) mitokondria Sus scrofa hanya spesifik untuk DNA babi, sedangkan primers D-Loop mitokondria Bos taurus (C) hanya spesifik untuk DNA sapi. Dari hasil pengujian terhadap ketiga primers diperoleh nilai batas deteksi primers A, B, C masing-masing 1 pg, 10 pg dan 100 pg. Nilai efisiensi primers A, B, C masing-masing 242,58%, 82,7% dan 97,1% , nilai koefisien determinasi (R2) primers A, B, C masing-masing 0,956; 0,732 dan 0,884 dan nilai koefisien variasi (CV) primers A, B, C masing-masing 4,39%, 1,81% dan 0,77%. Hasil uji metode probe TaqMan menunjukkan bahwa primers probe yang dirancang yaitu TaqMan probe D-Loop mitokondria Sus scrofa (D) menunjukkan spesifik untuk DNA Babi dan Celeng, dan primers probe TaqMan D-Loop mitokondria Bos taurus (E) hanya spesifik untuk DNA sapi. Hasil pengujian terhadap kedua primers probe memberikan hasil batas deteksi primers D dan E masing-msing 5 pg dan 100 pg. Nilai efisiensi primers D dan E masing-masing 59,4% dan 41,6%. Nilai koefisien R2 primers D dan E masing-masing 0,940 dan 0,995 dan nilai CV untuk primers D dan E masing-masing 1,69% dan 2,48%. Analisis multiplex menggunakan primers B dan C dilakukan dengan cara melakukan amplifikasi DNA babi dan DNA sapi secara simultan. Hasil analisis multiplex menunjukkan bahwa kedua primers babi dan sapi dapat mendeteksi target DNA babi dan sapi secara simultan. Hal ini ditunjukkan dengan adanya kurva tunggal dengan dua puncak. Puncak ini terbentuk pada lokasi tertentu pada nilai Tm 77,0oC untuk DNA babi dan 81,5oC untuk DNA sapi. Dengan multiplex PCR, diperoleh nilai batas deteksi 0,1%, nilai R2 sebesar 0,997 dan nilai efisiensi 58,5%. Kesimpulannya adalah perancangan primers dan probe yang spesifik terhadap spesies babi dan sapi pada metode Real-Time Polymerase Chain Reaction menggunakan primer spesifik spesies dan Probe TaqMan dapat divalidasi dan digunakan untuk identifikasi DNA babi pada campuran daging babi dan daging sapi dalam bakso sapi.

Along with the enactment of the Halal Product Guarantee Law (UU-JPH) No. 33, 2014, food products circulating in Indonesia must be guaranteed halal. This study aims to develop Real-Time Polymerase Chain Reaction method using species-specific primers, Probe TaqMan and multiplex to detect pork contamination in beef meatball products using new primers and probes that have been designed. The research stages consisted of testing the performance of the RT-PCR method using species-specific primers, TaqMan probe and multiplex on meatballs which included specificity tests, detection limits and efficiency, sensitivity and repeatibility. The results of the method test using species-specific primers showed that the primers designed, were cyt b (A) and D-Loop mitochondrial Sus scrofa (B) primers only specific to pork DNA, while Bos taurus mitochondrial D-Loop primers (C) were only specific to beef DNA. From the test results of the three primers, the detection limit values were obtained up to a concentration of 1 pg, 10 pg and 100 pg for primers A, B and C respectively. The efficiency values of each were 242.58%, 82.7% and 97.1% for primers A, B and C with the coefficient of determination (R2) was 0.956; 0.732 and 0.884 for primers A, B and C. The coefficient of variation (CV) was 4.39%, 1.81% and 0.77% for primers A, B, and C. The test results of the TaqMan probe method showed that the Probe TaqMan D-Loop mitochondrial Sus scrofa (D) was specific for pork and Boar DNA, and the Probe TaqMan D-Loop mitochondrial Bos taurus (E) was specific only for beef DNA. The test results for both primers gave detection limits of up to 5 pg and 100 pg concentrations for primers D and E. The Efficiency values of each were 59.4% and 41.6%, for primers D and E, the Coefficient of determination (R2) was 0.940 and 0.995 for primers D and E, and The coefficient of variation (CV) was 1.69% and 2.48% for primers D and E respectively. Multiplex analysis using primers B and C was carried out by simultaneously amplifying pork DNA and beef DNA. The results of the multiplex analysis showed that both pork and beef primers in the multiplex test could detect the DNA target of porks and beef simultaneously. This is indicated by the existence of a single curve with two peaks. This peak is formed at certain locations at a Tm value of 77.0oC for porks and 81.5oC for beef. With the multiplex PCR, the detection limit value was 0.1%, the R2 value was 0.997 and the efficiency value was 58.5%. The conclusion is that the design of primers and TaqMan probes that are specific to pork and beef species using the Real-Time Polymerase Chain Reaction method can be validated and used to identify pork DNA in a mixture of pork and beef in beef meatballs.

Kata Kunci : Primers spesifik, TaqMan probe, multiplex RT-PCR, Autentikasi halal