Peningkatan Solubilitas Beta-Carbonic Anhydrase Rekombinan dari Chromohalobacter salexigens BKL5

BRILIANA SURYANI K, M. Saifur Rohman, M.Eng., Ph.D.; Dr. Yekti Asih Purwestri, M.Si.

2021 | Tesis | MAGISTER BIOTEKNOLOGI

Carbonic anhydrase (CA) merupakan metaloenzim yang mengkatalisis reaksi reversibel hidrasi karbon dioksida menjadi bikarbonat dan proton. Enzim ini berperan penting pada semua domain kehidupan untuk menyediakan substrat karbon dioksida maupun bikarbonat bagi reaksi enzimatis di dalam sel. Penelitian pendahuluan mengenai ekspresi beta-CA rekombinan dari Chromohalobacter salexigens BKL5 yang menggunakan vektor pET-28a pada sistem ekspresi Escherichia coli BL21(DE3) menunjukkan ekspresi beta-CA rekombinan yang tinggi namun solubilitas yang rendah. Penelitian ini bertujuan untuk meningkatkan solubilitas beta-CA rekombinan dengan menggunakan sistem ekspresi suhu rendah yang dilengkapi dengan ko-ekspresi molekul chaperone untuk membantu proses pelipatan protein rekombinan. Upaya tersebut dilakukan dengan mengganti vektor ekspresi dari pET ke pCold TF. pCold TF merupakan vektor ekspresi yang dilengkapi dengan trigger factor (TF) dan diaktivasi pada suhu rendah. Open reading frame (ORF) beta-CA dari pET-beta-CA dipindahkan ke pCold TF dengan menggunakan enzim restriksi NdeI dan HindIII, kemudian disisipkan pada sisi yang sama di vektor pCold TF. Ekspresi dan uji solubiltas beta-CA rekombinan menggunakan gel SDS-PAGE 12%. Aktivitas beta-CA rekombinan diuji secara kualitatif menggunakan protonografi. Pada penelitian ini, penggunaan vektor ekspresi pCold TF mampu menghasilkan 83% dari beta-CA rekombinan dalam bentuk larut. Uji aktivitas enzim menunjukkan aktivitas hidrasi karbon dioksida dari beta-CA rekombinan. Hasil ini menjelaskan bahwa beta-CA rekombinan dengan bantuan TF dapat menyebabkan pelipatan protein yang sempurna.

Carbonic anhydrase (CA) is a metalloenzyme that catalyzes the reversible hydration of carbon dioxide to bicarbonate and proton. This enzyme plays an important role in all life kingdoms to provide carbon dioxide and bicarbonate substrates for enzymatic reactions in cells. Previous research on recombinant beta-CA expression from Chromohalobacter salexigens BKL5 that used pET-28a vector in Escherichia coli BL21(DE3) expression system showed high recombinant beta-CA expression but low solubility. This study aims to increase the solubility of recombinant beta-CA by using a low-temperature expression system, complete with co-expression of molecular chaperone to assist the folding process of recombinant proteins. This effort was performed by replacing the expression vector from pET to pCold TF. The pCold TF is an expression vector that is complete with trigger factor (TF) and activated at low temperatures. Open reading frame (ORF) of beta-CA from pET-beta-CA was transferred to pCold TF using NdeI and HindIII restriction enzymes, then inserted into the same site of pCold TF vector. The expression and solubility test of recombinant beta-CA used 12% SDS-PAGE gel. Recombinant beta-CA activity was analyzed qualitatively using protonography. In this study, the use of pCold TF expression vector was able to produce 83% of recombinant beta-CA in soluble form. The enzymatic activity assay showed the carbon dioxide hydration activity of recombinant beta-CA. These results indicate that the recombinant beta-CA with the assistance of TF leads to complete protein folding.

Kata Kunci : beta-carbonic anhydrase, Chromohalobacter salexigens BKL5, karbon dioksida, bikarbonat, solubilitas protein rekombinan