Aktivitas Antioksidan Tumbuhan Terpilih Dari Ramuan Empiris Untuk Penyakit Liver: Kajian Fisika-Kimia dan Biologi Molekular

HARTO WIDODO, Prof. Dr. apt. Abdul Rohman, M.Si.; Prof. Dr. apt. Sismindari, S.U.; Prof. Dr. drh. Widya Asmara, S.U.

2021 | Disertasi | DOKTOR BIOTEKNOLOGI

Penyakit kronis dan penyakit degeneratif terkait lainnya telah menjadi permasalahan kesehatan secara global dan prevalensinya terus meningkat. Patofisiologi berbagai penyakit degeneratif berkaitan erat dengan stres oksidatif (SO). Penyebab SO adalah meningkatnya jumlah oksidan khususnya reactive antioxidant species (ROS) yang dipicu oleh faktor internal maupun faktor eksternal dan berkurangnya jumlah dan aktivitas antioksidan (AAO) endogen seperti superoxide dismutases (SOD), catalase (CAT), Glutathione-S-transferase (GSt) serta tidak tercukupinya asupan antioksidan (AO) dari luar tubuh. Liver merupakan organ target utama SO yang berakibat prevalensi penyakit liver semakin tinggi. Tumbuhan yang mengandung berbagai fitokimia merupakan sumber AO yang sangat penting. Indonesia selain memiliki biodiversitas tumbuhan yang tinggi juga memiliki keberagaman suku (etnisitas) dan budaya. Pengobat tradisional (battra) dari berbagai etnis memanfaatkan beragam tumbuhan untuk mengobati berbagai penyakit merupakan aspek yang menarik untuk dipelajari. Riset Tumbuhan Obat dan Jamu (dikenal sebagai RISTOJA) tahun 2012, 2015, dan 2017 telah menginventarisir 380 tumbuhan yang digunakan oleh battra untuk pengobatan penyakit liver, 14 diantaranya terpilih untuk dikaji utamanya karena belum banyak publikasi ilmiah terkait AAO tumbuhan tersebut. Tujuan penelitian ini adalah menguji AAO tumbuhan terpilih secara in vitro kimiawi, biologis maupun secara in vivo sehingga untuk mendaptkan fraksi dengan AAO paling tinggi. Sampel tumbuhan dikeringkan, diserbuk, disaring (60 mesh) dan dimaserasi untuk memperoleh ekstrak metanol kasar (EMK). EMK dianalisis kandungan flavonoid total (KFT) dan fenol total (KFnT) serta diuji AAO secara in vitro kimia menggunakan metode DPPH Radical Scavenging Activity, ABTS Radical Cation Decolorization Assay, dan Ferric Reducing-Antioxidant Power (FRAP) Assay. EMK Macaranga subpeltata dan Baccaurea racemosa menunjukkan AAO lebih tinggi selanjutnya difraksinasi mengunakan n-hexan, diklorometan, kloroform, etil asetat, etanol, dan air sehingga dihasilkan berturut-turut fraksi heksan (FH), fraksi diklorometan (FD), fraksi kloroform (FK), fraksi etilasetat (FEA), fraksi etanol (FEt), fraksi air (FA), dan residu (FR). Pengujian AAO terhadap seluruh fraksi menunjukkan bahwa FEA M. subpeltata lebih baik daripada fraksi lainya serta menunjukkan daya penangkapan radikal bebas lebih baik dari pada standard pembanding baik L(+)-ascorbic acid (vitamin C) maupun silymarin. Pengujian AAO secara in vitro dilakukan pada sel line Vero dan HepG2, sedangkan secara in vivo pada tikus Sprague Dawley (SD) jantan yang dinduksi kerusakan hati menggunakan CCl4. Perlakuan 1 mM H2O2 meningkatkan produksi ROS sel Vero hingga 1,6 kali dari kontrol, sedangkan pemberian FEA M. subpeltata dan silymarin masing-masing dengan dosis 150 u­g/mL berturut-turut menurunkan produksi ROS sebesar 50% dan 44%. FEA 50 ug/mL meningkatkan sel Vero hidup hingga 9,53% sedangkan silymarin 50 ug/mL sebesar 8,09%. Pada dosis 150 ug/mL FEA meningkat sel Vero hidup hingga 10,24% sedangkan silymarin sebesar 12,54%. CCl4 dosis 2 mL/kg BB diberikan pada hari ke-4 dan ke-8 mengakibatkan tekanan pertambahan berat badan (BB) tikus SD jantan, menimbulkan kerusakan hepatosit seperti degenarasi hidrofik, steatosis, dan akumulasi glikogen, serta ditandai dengan meningkatnya serum alanin transaminase (ALT), aspartat transaminase (AST), dan conjugated bilirubin (CB). Pemberian senyawa AO (FEA M. subpeltata dosis 50, 100, 150 mg/kg BB; 100 mg/kg BB silymarin; dan butil hidroksi anisol/BHA dosis 10 mg/kg BB) selama 10 hari mampu mencegah tekanan pertambahan BB dan kerusakan liver akibat pemberian CCl4. FEA dan silymarin dosis 100 mg/kg BB memiliki kemampuan yang setara dalam mencegah penurunan BB sedangkan BHA 10 mg/kg BB memiliki kemampuan yang paling rendah. Senyawa AO mampu mencegah dan memperbaiki kerusakan hepatosit dari SO yang diakibatkan oleh metabolisme CCl4. FEA M. subpeltata mampu mencegah lipid peroksidasi yang ditandai dengan kadar malondialdehid (MDA) yang normal, meningkatkan protein total liver, dan meningkatnya AO endogen liver (terutama SOD dan GSt) yang sebanding dengan silymarin maupun BHA. AAO FEA M. subpeltata dalam mencegah SO baik in vitro maupun in vivo melalui mekanisme: penangkapan radikal bebas, agen pereduksi, pengkelat logam, pencegah peroksidasi lipid, dan aktivasi antioksidan endogen. Tumbuhan obat yang digunakan oleh pengobat tradisonal merupakan data base yang sangat penting untuk mengekplorasi senyawa antioksidan baru. Faksi etil asetat dari M. subpeltata menunjukkan potensi yang baik untuk dimanfaatkan lebih lanjut.

A chronic and other degenerative-related diseases have become a global health problem and the prevalence continues to increase. The pathophysiology of those various degenerative diseases is closely related to oxidative stress (OS), an imbalance state of the oxidant-antioxidant system. It may occur due to an increase of oxidants level especially reactive antioxidant species (ROS), a reduction of the number and activity of endogenous antioxidants such as superoxide dismutases (SOD), catalase (CAT), Glutathione-S-transferase (GSt), and insufficient dietary intake of antioxidants (AO). The liver is the main target organ of OS, a consequence of a high prevalence of the liver disease. Plants containing various phytochemicals are very important sources of AO. Apart from having immense plant biodiversity, Indonesia also has ethnic and cultural diversities. Traditional healers (battra) of various ethnicities utilizing plants for treating many diseases is an enticing aspect to be studied. The research on medicinal plants and 'Jamu' (known as RISTOJA) in 2012, 2015, and 2017 has inventoried 380 plants utilized by battra for liver disease treatment, 14 of those were selected to study mainly based on the scarce information of their OA activity (AOA). The purpose of this study was to investigate the AAO of selected plants both in vitro and in vivo to obtain the fraction with the highest AAO. The plant samples were dried, powdered, filtered (60 mesh), and macerated to obtain crude methanol extract (CME). The CMEs were analyzed for total flavonoid content (TFC) and total phenolic content (TPC) and examined for in vitro AOA using the DPPH Radical Scavenging Activity method, ABTS Radical Cation Decolorization Assay, and Ferric Reducing-Antioxidant Power (FRAP) Assay. Principal Component Analyses (PCA) upon the result of those series tests showed that CME of Macaranga subpeltata and Baccaurea racemosa exhibited higher AOA. These two CMEs then fractionated using n-hexane, dichloromethane, chloroform, ethyl acetate, ethanol, and water to obtain HF, DF, CF, EAF, EtF, WF, and also a residue (R) respectively prior to evaluating their AOA. The TFC, TPC, and AOA evaluations showed that the EAF of M. subpeltata was superior to other fractions and exhibited a higher free radical scavenging activity than those standards both L(+)-ascorbic acid (vitamin C) and silymarin. In vitro AOA evaluation was carried out on Vero and HepG2 cell lines, while in vivo AOA assessment was done on male Sprague Dawley (SD) rats treated with CCl4 to induced liver damage. Vero cell ROS production increased 1.6 fold by treatment of 1 mM H2O2, whereas the giving of EAF M. subpeltata and silymarin at the same dose of 150 ug/mL were able to reduce the ROS production by 50% and 44% respectively. The giving of FEA 50 ug/mL increased the alive of Vero cells by 9.53% while silymarin 50 ug/mL was 8.09%. Compared to untreated cells, EAF at a dose of 150 ug/mL increased the alive of Vero cells by 10.24% while silymarin was 12.54%. CCl4 at doses of 2 mL/kg BW by gavage administration on the 4th and 8th days indicated oppression on male SD rats' weight gain. Rats receiving the CCl4 displayed hepatocyte damage such as hydropic degeneration, steatosis, and accumulation of glycogen. It also markedly elevated serum alanine transaminase (ALT), aspartate transaminase (AST), and conjugated bilirubin (CB). A consecutive 10 day-administration of AOs (EAF M. subpeltata at doses of 50, 100, 150 mg/kg BW; silymarin at a dose of 100 mg/kg BW; and butyl hydroxy anisol/BHA at a dose of 10 mg/kg BW) were capable of discharging weight gain oppression and alleviating of liver damage due to CCl4 treatment. EAF and silymarin at a dose of 100 mg/kg BW exhibited the same capacity to prevent weight loss, while BHA 10 mg/kg BW resulted in the lowest demonstration. AO compounds can prevent and repair OS hepatocytes due to CCl4 intoxication. The EAF of M. subpeltata decreased malondialdehyde (MDA) to a normal level an indication of lipid peroxidation prevention, increase of total liver protein, and enhance liver endogenous AO (especially SOD and GSt) of SD rats compared to those CCl4-treated rats which were equal to the effect of silymarin and BHA administration. The AOA mechanisms in which FEA of M. subpeltata preventing OS both in vitro and in vivo were through: free radical scavenging, reducing agents, metal chelating, preventing lipid peroxidation, and activating of endogenous antioxidants. Medicinal plants used by traditional healers are a very important database for exploring new antioxidant compounds. The ethyl acetate fraction of M. subpeltata showed potential AAO properties for further utilization.

Kata Kunci : antioxidant, ramuan penyakit hati, in vitro, in vivo