PENGEMBANGAN BIOSENSOR APTAMER DAN PROBE MOLECULAR BEACON UNTUK AUTENTIKASI HALAL PRODUK PANGAN TERKONTAMINASI BABI (Sus scrofa domestica)

HARI WIDADA, Prof. Dr. apt. Sismindari, S.U.; Prof. Dr. apt. Abdul Rohman, M.Si.; Dr. apt. Riris Istighfari Jenie, M.Sc.

2021 | Disertasi | DOKTOR ILMU FARMASI

Authentikasi merupakan bagian dari usaha menghindari kerentanan pasokan produk makanan dari potensi kontaminasi komponen non-halal. Ketersediaan metode atau alat deteksi yang memiliki akurasi dan sensitifitas tinggi, murah, dan mudah dijangkau akan sangat membantu proses tersebut. Aptamer merupakan oligonukleotida untai pendek yang berupa RNA atau ssDNA menjadi bioreseptor yang menjanjikan karena memiliki selektifitas, sensitifitas dan stabilitas yang sangat baik. Selain aptamer biosensor alternatif yang dapat dieksplorasi menjadi sistem deteksi halal adalah probe Molecular Beacon (MB). MB merupakan biosensor berbasis sekuen DNA untai tunggal yang mempunya struktur yang unik. Penelitian ini melakukan desain aptamer menggunakan GO-SELEX terhadap target gelatin babi dan mendesain probe MB dengan target DNA babi. Aptamer dan probe MB yang dihasilkan digunakan sebagai biosensor dengan menggunakan platform nanopartikel (grafen oksida) dan AuNP untuk otentikasi halal. Aptamer dihasilkan dari proses seleksi menggunakan metode SELEX yang dibantu dengan grafen oksida (GO). Pemurnian proses seleksi dilakukan dengan Teknik PCR asimetris. Selektivitas dalam seleksi dilakukan dengan Langkah counter GO-SELEX menggunakan gelatin sapi, gelatin ikan dan gelatin nabati. Produk selksi di-sequencing kemudian dioptimasi konformasinya dengan perangkat lunak UNAFold secara online. Probe MB didesain secara in silico dengan perangkat lunak Beacon Designer 7.5. MB dikembangkan dengan modifikasi ujung 5 dan 3 menggunakan fluoresen-quencher, quencher-free, dan thiolisasi ujung 5 untuk diaplikasikan dalam sistem deteksi. Sistem deteksi yang digunakan adalan PCR, Spektrofluorometri dan dan Kolorimetri dengan bantuan platform AuNP. Hasil proses seleksi Aptamer dengan metode GO-SELEX, menghasilkan 4 (empat) kandidat aptamer yaitu: (1) Porc_Gel_Apt-1, (2) Porc_Gel_Apt-2, (3) Porc_Gel_Apt-3, dan (4) Porc_Gel_Apt-4. Kandidat aptamer dioptimasi secara in silico menghasilkan Porc_Gel_Apt-4 merupakan kandidat terkuat dengan nilai energi bebas = -5,88 kcal/mol at 37°C dan TM 63oC. Probe MB dengan sekuen 5-CGC GAT CAC AAA TGT GTG TAA CTG ATG AGA AGA TCG CG-3 berpotensi dikembangkan dalam system deteksi secara PCR, Spektrofluorometri maupun Kolorimetri dengan bantuan AuNP. Aptamer hasil pengembangan dengan metode GO-SELEX dengan target gelatin babi masih memiliki banyak kelemahan. Perlu dilakukan pengujian lebih lanjut untuk menghasilkan system deteksi terbaik menggunakan probe MB.

Authentication is a part of an effort to avoid the vulnerability of food product supply from potential contamination of non-halal components. The availability of a method or a detection tool that has a high accuracy and sensitivity, is cheap, and easy to reach will greatly assist this process. Aptamer is a short strand oligonucleotide in the form of RNA or ssDNA, and it can be a promising bioreceptor because of its excellent selectivity, sensitivity and stability. Apart from aptamer, an alternative biosensor that can be explored into a halal detection system is Molecular Beacon (MB) probe. MB is a single-stranded DNA sequence-based biosensor which has a unique structure. This study conducted an aptamer design using GO-SELEX against porcine gelatin targets, and designed an MB probe targeting pig DNA. The resulting aptamer and MB probe were used as biosensors by using nanoparticle (graphene oxide) and AuNP platforms for halal authentication. Aptamer was produced from the selection process using SELEX method assisted by graphene oxide (GO). The purification of the selection process was carried out by asymmetric PCR technique. Selectivity in the selection was done with a counter step, GO-SELEX, using beef gelatin, fish gelatin and vegetable gelatin. The selected product was sequenced, and the conformation was then optimized using UNAFold online software. The MB probe was designed in silico with Beacon Designer 7.5 software. MB was developed with a 5 'and 3' tip modification by using fluorescence-quencher, quencher-free, and 5 'tip thiolization for application in detection systems. The detection systems were PCR, Spectrofluorometry and Colorimetry with the help of AuNP platform. The results of the aptamer selection process with GO-SELEX method resulted in 4 aptamer candidates: (1) Porc_Gel_Apt-1, (2) Porc_Gel_Apt-2, (3) Porc_Gel_Apt-3, and (4) Porc_Gel_Apt-4. The aptamer candidates were optimized in silico and generated Porc_Gel_Apt-4, which was the strongest candidate with free energy = -5,88 kcal/mol at 37°C and TM 63oC. The MB probe with the 5'-CGC GAT CAC AAA TGT GTG TAA CTG AGA AGA TCG CG-3 'sequence has the potential to be developed in PCR, Spectrofluorometric and Colorimetric detection systems with the assistance of AuNP. Aptamer, aquired from GO-SELEX method with pork gelatin as its target, still has many weaknesses. Further testing is needed to produce the best detection system using the MB probe.

Kata Kunci : Aptamer, AuNP, DNA, gelatin, GO-SELEX, graphene oxide, Molecular Beacon probe, pork (Sus scrofa domestica)