Rekombinasi Plasmid pWYH257-cbhA dan Transformasi Plasmid Rekombinan secara Heat Shock dan Elektroporasi

JOSEPH C, Dr. Niken Satuti Nur Handayani, M.Sc.

2020 | Skripsi | S1 BIOLOGI

Penggunaan selulosa sebagai bahan baku produksi bioetanol memerlukan jalur enzimatik untuk mengurai selulosa. Jalur enzimatik memerlukan biaya yang cukup tinggi sehingga dibutuhkan alternatif berupa penyisipan gen selulase untuk menghasilkan strain yang memiliki aktivitas selulolitik. Penelitian ini bertujuan untuk mengamplifikasi dan menyisipkan gen cbhA dari Aspergillus niger pada vektor ekspresi yeast (pWYH257) serta membandingkan efektivitas metode transformasi secara heat shock dan elektroporasi. RNA total dari Aspergillus niger diisolasi sebagai template untuk memperoleh cDNA dengan RT-PCR. Amplifikasi gen cbhA melalui PCR menggunakan primer spesifik dan divisualisasi dengan elektroforesis. Gen cbhA sebagai insert dan pWYH257 sebagai vektor dipotong menggunakan enzim restriksi PstI dan SpeI. Insert dan vektor diligasi dengan T4 DNA ligase. Plasmid rekombinan ditransformasi ke sel kompeten E. coli DH10B dengan metode heat shock dan elektroporasi. Colony PCR dilakukan untuk memeriksa keberadaan cbhA dalam transforman. Pada penelitian ini, gen cbhA yang diamplifikasi berukuran 1.514 bp, dan berhasil disisipkan ke dalam dua sel transforman. Transformasi menggunakan metode elektroporasi lebih efektif dibandingkan dengan heat shock.

Utilization of cellulose as a raw material for bioethanol production requires an enzymatic pathway to break down cellulose. The enzymatic pathway requires high enough cost therefore an alternative is needed in the form of cellulase gene insertion to produce strains with cellulolytic activity. This study aims to amplify and insert the cbhA gene from Aspergillus niger in the yeast expression vector (pWYH257) and compare the effectiveness of transformation method by heat shock and electroporation. Total RNA from Aspergillus niger was isolated as a template for obtaining cDNA by RT-PCR. Amplification of the cbhA gene through PCR used specific primers and visualized by electrophoresis. cbhA gene as insert and pWYH257 as vector were cut using the PstI and SpeI restriction enzymes. Insert and vector were ligated with T4 DNA ligase. Recombinant plasmid was transformed into E. coli DH10B competent cells by heat shock and electroporation methods. Colony PCR was performed to determine cbhA existance inside transformant. In this research, the size of amplified cbhA gene was 1514 bp, and successfully cloned into two transformant cells. Transformation using electroporation method is more effective than heat shock.

Kata Kunci : Aspergillus niger, cbhA, elektroporasi, heat shock, pWYH257