Analisis Fungsional Gen Embrio AtRKD4 pada Tanaman Dendrobium lineale Rolfe Pembawa 35S::GR::AtRKD4

NI LUH PUTU KAYIKA F, Dr. Endang Semiarti, M.S., M.Sc.

2020 | Tesis | MAGISTER BIOLOGI

Dendrobium lineale Rolfe adalah anggrek endemik Papua yang terancam punah karena adanya eksploitasi dan bencana alam. Oleh karena itu diperlukan upaya untuk perbanyakan tanaman, baik secara in situ maupun ex situ untuk menjaga anggrek ini dari ancaman kepunahan. Perbanyakan tanaman secara massal untuk konservasi dapat dilakukan dengan teknik kultur in vitro. Salah satu metode teknik kultur in vitro yaitu melalui pembentukan embrio somatik (SEs). Embrio somatik dapat diproduksi dengan penyisipan gen embrio AtRKD4 ke protokorm anggrek D.lineale menggunakan Agrobacterium-mediated transfomation dengan plasmid pTA7002 yang membawa T-DNA pembawa 35S::GR::AtRKD4. Penelitian ini bertujuan untuk: 1) mendeteksi integrasi gen AtRKD4 dalam genom transforman, 2) menganalisis dinamika ekspresi gen AtRKD4 selama diinduksi dengan dexamethasone (DEX) atau thidiazuron (TDZ), 3) mendeteksi terbentuk/tidaknya protein AtRKD4 dengan menganalisis profil protein setelah dilakukan inisiasi pembentukan embrio somatik, 4) mengetahui pengaruh pemberian DEX dan TDZ terhadap pembentukan embrio somatik pada berbagai tipe eksplan tanaman transforman D. lineale. Tahapan penelitian yang dilakukan adalah subkultur tanaman kandidat transforman pada medium NP0, konfirmasi integrasi gen AtRKD4 pada genom transforman dengan PCR, induksi ekspresi gen AtRKD4 dengan DEX 15 mikromolar atau TDZ 3 mg/L, deteksi protein AtRKD4 setelah diinduksi dengan DEX 15 mikromolar atau TDZ 3 mg/L menggunakan SDS-PAGE dan induksi pembentukan embrio somatik pada eksplan batang, daun dan akar anggrek D. lineale dengan penambahan DEX (0, 5, 10, 15 mikromolar) dan TDZ (0, 1, 3 mg/L) pada medium NP selama 5 hari kemudian dipindahkan ke medium NP0. Hasil penelitian menunjukkan bahwa stabilitas T-DNA yang membawa gen AtRKD4 masih terjaga pada 10 tanaman transforman D. lineale berumur 1 tahun 6 bulan. Pemberian DEX atau TDZ dapat menginduksi ekspresi transgen AtRKD4 pada tanaman transforman anggrek D. lineale paling tinggi pada 5 hari induksi. Protein AtRKD4 dengan berat molekul 28,53 kDa dihasilkan pada tanaman transforman anggrek D. lineale. Kombinasi DEX 15 mikromolar + TDZ 1 mg/L mampu menginduksi pembentukan embrio somatik terbaik pada eksplan batang tanaman transforman anggrek D. lineale dengan pembentukan embrio sebesar 60% dan rerata embrio sebesar 35,67 plus atau minus 2,08.

Dendrobium lineale Rolfe is an endemic orchid of Papua that is threatened to be extinct due to over-exploitation and natural disasters. It takes effort to multiply both in situ and ex situ to keep these orchids from the threat of extinction. Mass propagation of plant can be done by tissue culture. One of the method is mass propagation by using production of somatic embryos (SEs) for the conservation of the orchid. SEs can be produced by using Agrobacterium-mediated transfomation of embrio gene AtRKD4 into orchid protocorms using pTA7002 plasmid that carrying 35S::GR::AtRKD4. The objectives of this study were to: 1) detect the integration of the AtRKD4 gene in the transformant genome, 2) analyze the dynamics expression of the AtRKD4 gene during induction with DEX or TDZ, 3) detect the AtRKD4 protein by using a protein profile on the initiation of somatic embryo formation, 4) determine the effect of dexamethasone and thidiazuron for the formation of somatic embryos in various explants of D. lineale transformant plants. The experiment were conducted in 5 steps: subcultures of transformant candidate plants in NP0 medium, confirmation of integration of the AtRKD4 gene in transformant genome with PCR, induction of AtRKD4 transgene expression with DEX 15 micromolar or TDZ 3 mg/L, detection of AtRKD4 protein after induced by DEX 15 micromolar or TDZ 3 mg/L using SDS-PAGE and induction of somatic embryo formation in stem, leaf and root explant of D. lineale orchid with addition of DEX (0, 5, 10, 15 micromolar) and TDZ (0, 1, 3 mg/L) on NP medium for 5 days and then transfered into NP0 medium. The results showed that the stability of T-DNA carrying AtRKD4 gene was maintained in 10 D. lineale transformant plants aged 1 year and 6 months. Induction of DEX or TDZ can induce AtRKD4 transgene expression in D. lineale orchid transformants with the highest was at 5 days induction. AtRKD4 protein with a molecular weight of 28.53 kDa was produced in D. lineale orchid transformant plants. The combination of DEX 15 micromolar + TDZ 1 mg/L was able to induce the best somatic embryo formation in stem explants of D. lineale orchid transformants with 60% embryo formation and the average formed was 35.67 plus minus 2.08 embryos.

Kata Kunci : AtRKD4, D. lineale, dexamethasone-thidiazuron, embriogenesis somatik, protein