Purifikasi Dan Karakterisasi Enzim Lipase Ekstraseluler Dari Bakteri Alcaligenes sp. JG3

PUJI LESTARI, Tri Joko Raharjo, S.Si., M.Si., Ph.D; Prof. Drs. Sabirin Matsjeh, Ph.D; Dr. Winarto Haryadi, M.Si

2018 | Disertasi | DOKTOR KIMIA

Telah dilakukan penelitian tentang purifikasi dan karakterisasi enzim lipase ekstraseluler dari bakteri Alcaligenes sp. JG3. Tahap-tahap penelitian yang dilakukan adalah: peremajaan dan kultur isolat bakteri Alcaligenes sp. JG3, optimasi produksi lipase, produksi lipase ekstrak kasar, fraksinasi lipase ekstrak kasar, dialisis lipase hasil fraksinasi, purifikasi lipase pekat dengan kromatografi kolom multi-step dan karakterisasi lipase hasil fraksinasi dan kromatografi. Fraksinasi dilakukan dengan penambahan garam amonium sulfat secara bertingkat pada tingkat kejenuhan 20 %, 40 %, 60 %, 80 % dan 100 %. Purifikasi lipase dilakukan dengan kromatografi kolom multi-step, dengan cara mengelusikan lipase pekat ke dalam kolom kromatografi penukar anion dengan matriks DEAE Cellulosa. Fraksi-fraksi dengan aktivitas tinggi dikumpulkan kemudian dielusikan ke dalam kolom kromatografi filtrasi gel dengan matriks Sephadex G-100. Fraksi dengan nilai aktivitas paling tinggi ditentukan karakteristiknya meliputi suhu optimum, pH optimum, pengaruh EDTA dan ion logam terhadap aktivitas, penentuan nilai KM dan Vmaks serta penentuan massa molekul lipase dengan SDS PAGE. Hasil penelitian menunjukkan bahwa enzim lipase ekstraseluler dari bakteri Alcaligenes sp. JG3 berhasil diisolasi dan dipurifikasi. Fraksinasi bertingkat menggunakan garam amonium sulfat menghasilkan fraksi-fraksi lipase dengan aktivitas spesifik lebih besar daripada aktivitas spesifik ekstrak kasar. Aktivitas spesifik terbesar diperoleh pada fraksi lipase yang difraksinasi dengan garam amonium sulfat pada tingkat kejenuhan 60%, dengan aktivitas spesifik sebesar 12.283,33 U/mg protein. Purifikasi menggunakan metode kromatografi kolom multi step menghasilkan lipase fraksi ke-8 dengan kemurnian tinggi dengan aktivitas spesifik sebesar 55.333,33 U/mg protein dan faktor purifikasi sebesar 210,42 kali. Karakteristik enzim lipase fraksi ke-8 adalah: suhu optimum 40 ºC; pH optimum 7,0; EDTA menghambat aktivitas lipase, hal ini mengindikasikan bahwa enzim ini tergolong ke dalam metaloenzim; ion logam Ca2+ meningkatkan aktivitas; sedangkan ion logam Mg2+, Zn2+, Co2+ dan Cu2+ menurunkan aktivitas. Surfaktan dan deterjen komersial yang diujikan menurunkan aktivitas relatif lipase. Nilai KM dan Vmaks adalah: 12,4 mM dengan substrat minyak zaitun dan 90,91 µmol asam lemak bebas/menit/mL enzim. Massa molekul lipase adalah 188,86 kDa.

A study has been conducted on the purification and characterization of extracellular lipase enzymes from the bacteria of Alcaligenes sp. JG3. The research steps are: rejuvenation and culture of Alcaligenes sp. JG3 bacterial isolates, optimization of lipase production, crude extract lipase production, crude extract lipase fractionation, dialysis of fractionated lipase, lipase purification with multi-step column chromatography and lipase characterization of fractionation and chromatography. Fractionation was done by adding ammonium sulfate at saturation level of 20 %, 40 %, 60 %, 80 % and 100 %. Lipase purification was performed by multi-step column chromatography, by means of eluting concentrated lipase into anion exchange chromatography column with DEAE Cellulose matrix. Fractions with high activity were collected then eluted into gel filtration chromatography columns with Sephadex G-100 matrix. The lipase fraction with the highest activity value was determined its characteristics including: optimum temperature, optimum pH, EDTA and metal ion effect on activity, determination of KM and Vmax values and molecular mass using SDS PAGE. The results showed that extracellular lipase from Alcaligenes sp. JG3 successfully isolated and purified. Fractionation using ammonium sulfate produces lipase fractions with specific activity greater than the specific activity of crude extracts. The largest specific activity was obtained in the lipase fraction fractionated with ammonium sulfate at 60 % saturation level, with specific activity of 12,283.33 U / mg protein. Purification using multi step chromatography method yielded high purity of 8th lipase fraction with specific activity 55,333.33 U/mg protein and purification factor of 210,42 times. Characteristics of the 8th lipase fraction enzyme are: optimum temperature 40 ºC; optimum pH 7.0; EDTA inhibits lipase activity, indicating that this enzyme belongs to metaloenzyme; Ca2+ metal ions increases activity; meanwhile metal ions Mg2+, Zn2+, Co2+ and Cu2+ decrease activity. The surfactants and commercial detergents tested decreased the relative activity of lipase. The values of KM and Vmax are: 12.4 mM with olive oil substrate and 90.91 μmol free fatty acid / min / mL enzyme. The molecular mass of lipase is 188.86 kDa.

Kata Kunci : Alcaligenes sp. JG3, lipase ekstraseluler, purifikasi, karakterisasi