ANALISIS EKSPRESI GEN AtRKD4 PADA ANGGREK Dendrobium phalaenopsis Fitzg. TRANSGENIK SELAMA INDUKSI EMBRIOGENESIS SOMATIK

ZULWANIS, Dr. Endang Semiarti, M.S., M.Sc.

2020 | Tesis | MAGISTER BIOLOGI

Dendrobium phalaenopsis adalah anggrek endemik Indonesia yang telah mengalami ancaman kepunahan. Salah satu metode perbanyakan yang dapat dilakukan untuk melestarikannya yaitu melalui embriogenesis somatik. Pada penelitian sebelumnya telah berhasil dilakukan transformasi genetik anggrek D. phalaenopsis dengan menyisipkan gen embrio Arabidopsis thaliana RKD4 (AtRKD4) melalui perantara Agrobacterium tumefaciens dengan plasmid pTA7002 yang membawa T-DNA dengan konstruksi 35S::GR::AtRKD4. Gen AtRKD4 terbukti mampu menginduksi protokorm D. phalaenopsis untuk membentuk embrio somatik dan telah tumbuh menjadi plantlet transforman dewasa. Tujuan penelitian ini adalah untuk (1) melakukan konfirmasi stabilitas keberadaan T-DNA yang membawa AtRKD4 pada transforman anggrek D. phalaenopsis, (2) mengetahui dinamika ekspresi transgen AtRKD4 pada eksplan daun anggrek D. phalaenopsis transforman selama proses induksi dengan Dexamethasone (DEX) atau Thidiazuron (TDZ), (3) mengetahui bagian eksplan anggrek D. phalaenopsis transgenik yang mampu menghasilkan embrio somatik, dan (4) mengetahui ekspresi gen SERK1 dan DOH1 pada saat pembentukan embrio somatik dari eksplan daun dan batang anggrek D. phalaenopsis transgenik. Tahapan penelitian yang dilakukan adalah konfirmasi integrasi T-DNA pada kandidat transforman, induksi embriogenesis somatik pada eksplan daun dengan DEX atau TDZ dengan 5 waktu induksi (1, 3, 5, 7, dan 9 hari), induksi embriogenesis somatik pada eksplan batang, daun, dan akar dengan DEX, dan analisis ekspresi gen AtRKD4, SERK1, dan DOH1 dengan metode RT-PCR. Hasil penelitian menunjukkan diperoleh 25 plantlet positif dari 35 kandidat transforman (71%), ekspresi tertinggi transgen AtRKD4 pada transforman diperoleh pada hari ke-5 baik induksi dengan DEX atau TDZ. Embrio somatik hanya muncul dari eksplan batang yang menghasilkan 14,6±1,5 embrio (induksi dengan 10 µM DEX) dan 22,5±1,4 embrio (induksi dengan 15 µM DEX). Ekspresi gen SERK1 terdeteksi pada daun dan mengalami peningkatan pada batang, ekspresi gen DOH1 hanya terdeteksi pada embrio somatik yang membentuk tunas, sedangkan gen AtRKD4 dapat terdeteksi pada daun dan mengalami peningkatan pada embrio somatik. Data ini mengindikasikan bahwa gen AtRKD4 dapat berfungsi normal pada genom D. phalaenopsis.

Dendrobium phalaenopsis is an Indonesian endemic orchid that threaten to be extinct. A propagation method can be done to preserve this species is through somatic embryogenesis. In previous studies, the genetic transformation of the D. phalaenopsis was carried out by inserting the Arabidopsis thaliana RKD4 (AtRKD4) embryo gene using Agrobacterium tumefaciens with a pTA7002 plasmid that carries T-DNA with 35S::GR::AtRKD4 construction. The AtRKD4 gene is proven to be able to induce the D. phalaenopsis protocorm to create somatic embryos and has grown into adult transformant plantlets. The purposes of this study were to (1) confirm the existance T-DNA carrying AtRKD4 in the genom of D. phalaenopsis transformants, (2) know the dynamic expression of AtRKD4 transgene in the leaves of D. phalaenopsis transformants during induction process with Dexamethasone (DEX) or Thidiazuron (TDZ), (3) determine the D. phalaenopsis transgenic explant that is capable of producing somatic embryos, and (4) analyze the expression of AtRKD4, SERK1, and DOH1 genes in the time of producing somatic embryos from leaf and stem explants. The stages of research were confirmation of T-DNA in transformant candidates, induction of somatic embryogenesis in leaf explants by DEX or TDZ in 5-time points (1, 3, 5, 7, 9 days of induction), induction of somatic embryogenesis in explants of stems, leaves, and roots with DEX, and analysis the AtRKD4, SERK1, and DOH1 gene expression with the RT-PCR method. The results showed that 25 positive plantlets were obtained from 35 transformant candidates (71%), the highest expression of AtRKD4 transgenes in transformants was obtained after 5 days induction either by DEX or TDZ. Somatic embryos only arise from stem explants that produce 14.6±1.5 embryos (induced by 10 μM DEX) and 22.5±1.4 embryos (induced by 15 μM DEX). The SERK1 gene expression was detected in the leaf explants and increased in the stem, the DOH1 gene expression could be detected only in the somatic embryo that produce buds, while the AtRKD4 gene can be detected in the leaf and increased in the somatic embryo explants. The data indicates that the AtRKD4 gene can function properly in the D. phalaenopsis genome.

Kata Kunci : Dendrobium phalaenopsis, embriogenesis somatik, AtRKD4, promoter inducible