Respons Imun Terhadap Protein Rekombinan Antigen 85A dan 85B M. tuberculosis Pada Mencit Balb/c

FIHIRUDDIN, Prof. Dr. drh. Wayan Tunas Artama; Prof. dr. Tri Wibawa, Ph.D.,Sp.MK(K); Prof.Dr.dr. Ni Made Mertaniasih, MS.,Sp.MK(K)

2019 | Disertasi | DOKTOR BIOTEKNOLOGI

Vaksin BCG (Bacillus Calmette-Guerin) konvensional masih digunakan sebagai vaksin utama dalam perlindungan dini terhadap M. tuberculosis. Proteksi vaksin ini kurang optimal mengatasi penularan dan prevalensi kasus tuberkulosis secara global sehingga diperlukan vaksin baru yang efektif dan efisien terhadap tuberkulosis. Protein kompleks antigen 85 M. tuberculosis merupakan salah satu target sistem imun dan berperan dalam menginduksi proliferasi sel T dan B. Tiga anggota protein Ag85 dengan berat molekul 30-32 kDa, meliputi Ag85A, Ag85B dan Ag85C. Ekspresi protein Ag85 diperlukan untuk kelangsungan hidup M. tuberculosis dalam makrofag dan diduga sebagai faktor virulensi. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan amplifikasi, kloning dan mengekspresi gen penyandi Ag85A dan Ag85B M. tuberculosis, serta memprediksi epitop sel T dan sel B dan menguji respon imun humoral dan selulernya pada mencit Balb/c. Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental yaitu melakukan kloning dan ekspresi gen penyandi Ag85 M. tuberculosis MDR untuk diujikan imunogenitasnya pada mencit Balb/c. Analisis perbandingan imunogenitas Ag85 menggunakan desain The Static Group Comparison Group. Pada rancangan ini, gen penyandi protein Ag85A dan Ag85 B di amplifikasi, dikloning dan diekspresikan pada sel kompeten E. coli BL 21 (DE3). Respon imun Ag85A dan Ag85B di uji secara in vivo menggunakan mencit Balb/c dan secara in vitro menggunakan kultur sel dengan berbagai perlakuan. Hasil amplifikasi gen fbpA dan fbpB adalah 1130 bp dan 978 bp dengan BM 36 kDa dan 34 kDa. Prediksi epitop Ag85A dan Ag85B terhadap sel T menggunakan GENETYX ver 8.0 di peroleh masing-masing 7 epitop, prediksi epitop sel B dengan ABCPred score diatas 0.83 diperoleh masing-masing 11 dan 9 epitope. Prediksi epitop MHC I (HLA-A*0201) dengan score diatas 59 dan MHC II (HLA DR17/DRB1*0301) dengan score di atas 5.0 menggunakan RANKPEP prediction ditemukan 15 dan 13 posisi epitop MHC I, serta 11 dan 8 posisi epitop MHC II. Uji MTT sel T menunjukkan aktivitas proliferasi paling tinggi dengan paparan Ag85B 10 µg/ml (OD 0.358), sedangkan sel B dengan pemberian gabungan protein Ag85A dan Ag85B 5 µg/ml (OD 0.346). Jumlah sel NK dan sel T CD8+ menggunakan flowcytometri paling besar di peroleh dari gabungan BCG dan Ag85B yaitu masing-masing 4.23% dan 1.03%. Konsentrasi granzyme B dan perforin ditemukan paling tinggi pada kelompok yang diberikan paparan BCG dan Ag85B, yaitu 34.45 pg/ml dan 6.19 pg/ml, sedangkan IL-1β dari gabungan BCG, Ag85A dan Ag85B yaitu 141.9 pg/ml. Uji statistik One-Way ANOVA dengan tingkat kepercayaan 95 % menunjukkan perbedaan signifikant kelompok perlakuan di banding kontrol dengan nilai p<0,05. Protein Ag85 M. tuberculosis MDR isolat klinik dapat dikombinasikan dengan vaksin BCG untuk meningkatkan proteksi terhadap infeksi M. tuberculosis dan sebagai bahan untuk membuat alat diagnostik untuk uji screening M. tuberculosis.

Conventional Bacillus Calmette-Guerin (BCG) vaccine is still used as the main vaccine in early protection against M. tuberculosis infections. The protection of this vaccine is low efficiency for overcoming transmission and epidemics of tuberculosis cases globally. therefore effective and efficient a new vaccine against tuberculosis is required. Antigen complex of proteins 85 of M. tuberculosis is one of the immune system targets and plays a role in inducing proliferation of T and B cells. There are three members of the Ag85 proteins (MW 30-32 kDa), consist of Ag85A, Ag85B and Ag85C. Expression of their proteins are reqiured for the survival of M. tuberculosis in macrophages and is considered a virulence factor. This study aims to amplify, clone and expression genes encoding of proteins Ag85A and Ag85B of M. tuberculosis, and predict of T cell and B cell epitopes and examine humoral and cellular immune responses in Balb/c mice. This research is a pre-exprimental study, that is cloning and expression of the encoding gene of Ag85 multi-drug resistant (MDR) of M. tuberculosis to be tested it immunogenicity in Balb/c mice. Comparative analysis of Ag85 immunogenicity using the design of The Static Group Comparison Group. In this design, the genes encoding Ag85A and Ag85 B proteins are amplified, cloned and expressed on competent E. coli BL 21 (DE3) cells. The immune responses of Ag85A and Ag85B proteins were tested in vivo using Balb/c mice and in vitro using cell cultures with various treatments. The results of fbpA and fbpB gene amplification were 1130 bp and 978, molecular weight of 36 kDa and 34 kDa respectively. Predictions of Ag85A and Ag85B to T cell epitopes using GENETYX ver 8.0 were obtained for each of 7 epitopes, prediction of B cell epitopes using ABCPred prediction with score above 0.83 were obtained 11 and 9 epitope respectively. MHC I epitope prediction (HLA-A*0201) with a score above 59 and MHC II (HLA DR17/DRB1*0301) with a score above 5.0 using RANKPEP prediction was found 15 and 13 epitope positions (MHC I), and 11 and 8 epitope positions (MHC II). In MTT test obtained that T cell showed the highest proliferation activity with exposure by 10 µg/ml Ag85B protein (OD 0.358), while B cell by exposure a combination of 5 µg/ml Ag85A and Ag85B proteins (OD 0.346). The highest number of NK cells and CD8+ T cells using flowcytometri was obtained from a combination of BCG and Ag85B, which were 4.23% and 1.03%, respectively. The concentration of granzyme B and perforin was found to be highest in the group given BCG and Ag85B exposure, were 34.45 pg/ml and 6.19 pg/ml respectively, whereas IL-1β from the combination of BCG, Ag85A and Ag85B (141.9 pg/ml). The One Way Anova statistical test with a 95% confidence level showed a significant difference in the treatment groups compared to the control with a value of p<0.05. The protein Ag85 of MDR M. tuberculosis from clinical isolates can be combined with the BCG vaccine to increase protection against M. tuberculosis infection and used to make diagnostic tools for M. tuberculosis screening tests.

Kata Kunci : M.tuberculosis, protein Ag85, vaccine, humoral immunity and cellular immunity