MicroRNA Profiling and Potential Treatment of 4-AAQB Against Oncomir in Triple Negative Breast Cancer

PAMUNGKAS BAGUS S, Prof.dr. Sofia Mubarika Haryana, M.Med.Sc., PhD; Prof.Dr.dr. Teguh Aryandono,Sp.B(K),Onk; Prof. Chi-Tai Yeh, PhD

2019 | Disertasi | DOKTOR ILMU KEDOKTERAN DAN KESEHATAN

Latar belakang: Disregulasi siklus sel biasanya terjadi pada kanker termasuk triple negative breast cancer (TNBC). Baru-baru ini, beberapa inhibitor farmakologis yang menargetkan checkpoints pada siklus sel yang disetujui oleh FDA untuk mengobati pasien breast cancer HR + / HER2- metastatik lanjut, tetapi tidak untuk pasien TNBC. Cyclin-dependent kinase (CDK) adalah mesin utama untuk mengatur siklus sel. Ekspresi dan aktivasi CDK diatur secara ketat oleh mekanisme tertentu seperti Wnt signaling pathway dan beberapa microRNA. Dengan memahami sumbu CDK/Wnt/microRNA, kami berharap dapat meningkatkan pengetahuan dasar tentang regulasi siklus sel pada TNBC dan untuk mengungkap kemungkinan pendekatan baru untuk mengobati pasien TNBC. Di sini kami memberikan bukti untuk mendukung pentingnya CDK/Wnt/microRNA dalam TNBC. Selain itu, kami menemukan small compound (4AAQB) yang dapat menghambat siklus sel melalui CDK 2/4 dalam sel TNBC. Metode: Untuk menyelidiki kandidat miRs terbaik yang mengalami upregulasi pada pasien TNBC, kami melakukan analisis Nanostring dan analisis bioinformatika menggunakan pasien TNBC Indonesia dan kumpulan open source dataset. Untuk mengeksplorasi mekanisme aksis CDK/Wnt, kami melakukan studi in silico, dan in vitro,. Pertama, untuk mengkonfirmasi pentingnya CDK 2/4/6 pada pasien kanker payudara, kami menggunakan 5 dataset yang diunduh dari cBioportal. Untuk menguji pentingnya CDK2/4 dalam karsinogenesis TNBC, kami melakukan studi in vitro. Setelah menghasilkan sel CDK2/4 knockdown, kami melakukan western blot, invasion, migration, dan tumorsphere assays. Untuk mengeksplorasi potensi aktivitas anti-kanker dari 4-AAQB, kami memberi perlakuan pada MDA-MB-231 dan Hs578t cell lines dengan beberapa dosis 4-AAQB. Selanjutnya, kami melakukan tes fungsional seperti SRB, western blot, annexin V, imunofluorescent, dan migration invasion assays. Hasil: Kami menemukan 10 miRs yang upregulasi dalam jaringan tumor primer pasien TNBC menggunakan uji Nanostring. Kami mengkonfirmasi bahwa hsa-miR-200c-3p dan hsa-miR-141-3p mengalami upregulasi dalam jaringan TNBC, sampel serum dan berkorelasi dengan prognosis pasien yang buruk. Dalam analisis in silico ditemukan bahwa siklus sel adalah pathway yang paling terpengaruh oleh 10 miRs yang mengalami upregulasi. Lebih lanjut, hasil kami menunjukkan upregulasi CDK2/4 memiliki korelasi yang signifikan terhadap kelangsungan hidup pasien breast cancer, tetapi tidak dengan CDK6. Studi in vitro menunjukkan bahwa penghambatan CDK2/4 melalui penekanan Wnt signaling pathway dapat mengganggu proliferasi sel, migrasi, invasi, dan tumorigenisitas sel TNBC. Perlakuan 4-AAQB menghambat ekspresi CDK2/4 sel TNBC (doses-dependent manner). Uji fungsional menunjukkan bahwa 4-AAQB dapat menekan agresivitas sel TNBC. Penghambatan CDK 2/4 dengan perlakuan 4-AAQB dapat menghambat proliferasi sel, serta memacu apoptosis, dan kerusakan DNA. Kesimpulan: Berdasarkan hasil yang didapatkan, kami menemukan bahwa aksis miRs/Wnt/CDK sebagai regulator penting dalam proliferasi sel di TNBC. Lebih lanjut, kami memberikan bukti kuat tentang efek terapi dari senyawa kecil 4-AAQB dengan cara menarget CDK2/4 dalam sel TNBC.

Background: Dysregulation of cell cycle commonly occurs in cancer including triple negative breast cancer (TNBC). Recently, some pharmacological inhibitors that targeted the cell cycle checkpoints were approved by the FDA to treat the advanced metastatic HR+/HER2- breast cancer patients, but not the TNBC patients. The cyclin-dependent kinases are the main machinery to control the cell cycle. The CDK expression and activation are tightly regulated by particular mechanisms such as the Wnt signaling pathway and some microRNAs. By understanding the axis of CDK/Wnt/microRNA, we hope to improve basic knowledge of cell cycle regulation in the TNBC and to uncover the possibility of a new approach to treat TNBC patients. Here we provided the evidence to support the importance of CDK/Wnt/microRNA in the TNBC. In addition, we found a potential small compound (4AAQB) that can inhibits cell cycle through CDK 2/4 in the TNBC cells. Methods: To investigate the best candidate of miRs that upregulated in the TNBC patients, we performed Nanostring assay and bioinformatics analysis using Indonesian TNBC patients and open source datasets. To explore the mechanism of CDK/Wnt axis, we performed in silico, in vitro, and in vivo studies. Firstly, to confirm the importance of CDK 2/4/6 in breast cancer patients, we used 5 datasets that were downloaded from cBioportal. To test the importance of CDK2/4 in carcinogenesis of TNBC, we performed in vitro. After generated the low expression of CDK 2/4 clone cells, we performed western blot, cell count, migration invasion, and tumorsphere assays. To explore the potential anti-cancer activity of the 4-AAQB, we treated the MDA-MB-231 and Hs578t cell lines with several doses of 4-AAQB. Further, we performed functional assays such as SRB, western blot, annexin V, immunofluorescent, and migration assays. Results: We found 10 upregulated miRs in the orimary tumor tissue of TNBC patients using the Nanostring assay. We confirmed that hsa-miR-200c-3p and hsa-miR-141-3p were upregulated in TNBC tissue, serum samples and correlated with the poor prognosis of patients. In silico analysis revealed that the cell cycle pathway was the most affected pathway by 10 upregulated miRs. Further, our results showed the CDK 2/4 upregulation have a significant correlation to the breast cancer patients overall survival, but not the CDK 6. In vitro study show that the CDK 2/4 inhibition through Wnt signaling pathway suppression disrupted the cell proliferation, migration, invasion, and the tumorigenicity of TNBC cells. The 4-AAQB treatment inhibited the CDK 2/4 expression of TNBC cells in a dose-dependent manner. The functional assays showed that the 4-AAQB could suppress the aggressiveness of TNBC cells. The CDK 2/4 inhibition with 4-AAQB induced cell proliferation inhibition, apoptosis, and DNA damages. Conclusion: Based on our results, we provide the basic knowledge of the miRs/Wnt/CDK axis as an important regulator in the cell proliferation in TNBC. Further, we provided compelling evidence of the potential therapeutic effects of a natural small compound, 4-AAQB by targeting the CDK2/4 in TNBC cells.

Kata Kunci : Breast cancer, TNBC, microRNA, Wnt, CDK 2/4, 4-AAQB.