Induksi Embriogenesis Somatik Tanaman Anggrek Phalaenopsis amabilis (L.) Blume dengan Zat Pengatur Tumbuh dan Transformasi Genetik

WINDI MOSE, Dr. Endang Semiarti, M.S., M.Sc.; Dr. Ir. Aziz Purwantoro, M.Sc.; Dr.rer.nat. Ari Indrianto, S.U.; Prof. Dr. Budi Setiadi Daryono, M.Agr.Sc.

2019 | Disertasi | DOKTOR BIOLOGI

Phalaenopsis amabilis (L.) Blume adalah anggrek asli Indonesia yang memiliki peran penting sebagai indukan pada berbagai persilangan untuk menghasilkan varietas hibrida unggul. Produksi bibit anggrek ini dalam jumlah besar, seragam, dan terus menerus sangat diperlukan untuk dapat memenuhi kebutuhan pasar lokal, nasional maupun internasional. Perbanyakan tanaman melalui embriogenesis somatik merupakan salah satu aplikasi bioteknologi yang sangat menjanjikan, karena setiap sel tubuh pada tanaman dapat diinduksi menjadi tanaman baru yang utuh pada medium buatan secara in vitro. Embriogenesis somatik dilakukan menggunakan variasi Zat Pengatur Tumbuh (ZPT) dan penyisipan gen kunci embriogenesis AtRKD4 dan homolognya pada tanaman anggrek, PRKD. Penelitian ini bertujuan untuk: 1) Mengetahui pengaruh pepton terhadap perkembangan embrio zigotik anggrek P. amabilis; 2) Mengetahui pengaruh kombinasi thidiazuron (TDZ) dengan auksin (NAA, 2,4-D, dan IAA) terhadap pembentukkan embrio somatik pada berbagai eksplan anggrek P. amabilis; 3) Menentukan profil transkriptomik tanaman anggrek P. amabilis yang mengekspresikan transgen AtRKD4; 4) Menentukan pengaruh ekspresi gen PRKD terhadap pembentukkan embrio somatik pada tanaman model Arabidopsis thaliana. Hasil penelitian menunjukkan bahwa perkembangan embrio anggrek P. amabilis mencapai optimal (fase 5 dan 6) pada medium NP dengan penambahan 2 g/L pepton. Induksi embriogenesis somatik dengan ZPT menunjukkan bahwa medium dengan penambahan 3 mg/L TDZ NAA dengan konsentrasi 1 mg/L merupakan kombinasi ZPT terbaik yang dapat menginduksi pembentukan embrio somatik terbanyak pada semua tipe eksplan anggrek P. amabilis. Eksplan batang merupakan eksplan yang paling responsif dalam pemebentukan embrio somatik pada semua kombinasi ZPT. Hasil transformasi genetik protokorm dengan gen 35S::GR::AtRKD4 menghasilkan frekuensi transformasi genetik sebesar 1,6 persen. Induksi embriogenesis somatik pada potongan eksplan (akar, batang, dan daun) tanaman transgenik dengan variasi konsentrasi Dex (0, 5, 10, 15, dan 20 mikromolar) menunjukkan bahwa Dex dengan konsentrasi 15 mikromolar merupakan konsentrasi terbaik yang dapat menginduksi pembentukan embrio somatik terbanyak dengan tipe eksplan yang paling responsif terhadap induksi dengan Dex adalah eksplan batang. Tanaman transgenik P. amabilis galur #23, #25, dan #29 menunjukkan ekspresi transgen AtRKD4 tertinggi dan menghasilkan rerata jumlah embrio somatik terbanyak. Analisis transkriptomik dengan RNA-sequencing pada sampel tanaman transgenik P. amabilis menunjukkan bahwa sebanyak 118 gen mengalami upregulasi dan 36 gen mengalami downregulasi setelah diinduksi dengan Dex selama 7 hari. Gen-gen yang mengalami upregulasi selama induksi dengan Dex adalah gen-gen yang berperan dalam developmental process. Sedangkan gen-gen yang mengalami downregulasi adalah gen-gen yang berperan dalam differentiation process. Kandidat gen PRKD berhasil menginduksi pembentukan embrio somatik pada tanaman Arabidopsis. Penelitian ini diharapkan dapat menjadi referensi perbanyakan klonal anggrek P. amabilis yang efektif melalui penggunaan ZPT (TDZ dan NAA) dan transformasi genetik melalui penyisipan gen AtRKD4 dan PRKD, dan data transkriptomik yang didapatkan dapat memperkaya database transkriptom tanaman anggrek yang berguna sebagai dasar perbanyakan tanaman anggrek.

Phalaenopsis amabilis (L.) Blume is an Indonesian native orchid that has an important role as parent to produce superior hybrid varieties. The production of uniform orchid seedlings in large and continuous quantities is necessary to meet local, national and international market demands. Plant propagation through somatic embryogenesis is a very promising application of biotechnology, because every cell in a plant can be induced into a whole new plant in an in vitro medium. Somatic embryogenesis was carried out using a variation of Plant Growth Regulators (PGRs) and the insertion of AtRKD4 gene and RKD homolog in orchid, PRKD. The objectives of this research were: 1) Determine the effect of peptone on the development of P. amabilis zygotic embryos; 2) Determine the effect of combinations of thidiazuron (TDZ) with auxins (NAA, 2,4-D, and IAA) on the formation of somatic embryos from various explants of P. amabilis; 3) Determine the trancriptomic profiles of P. amabilis orchid expressing AtRKD4 transgene; 4) Determine the effect of PRKD expression on somatic embryogenesis fromation in Arabidopsis thaliana. The results showed that the optimum development (phase 5 and 6) of P. amabilis orchid embryo reached on NP medium with the addition of 2 g/L peptone. Somatic embryogenesis induction using PGRs showed that medium with the addition of 3 mg/L TDZ and 1 mg/L NAA is the best combination which can induced the highest number of somatic embryos in all type of explants. Stem explants were the most responsive explants in the formation of somatic embryos in all combination of PGRs. The results of genetic transformation on protocorm with 35S::GR::AtRKD4 gene showed the genetic transformation frequency of 1.6 percent. Somatic embryogenesis induction on different type transgenic of explants (roots, stems, and leaves) with variations concentration of Dex (0, 5, 10, 15, and 20 micromolar) showed that Dex with a concentration of 15 micromolar was the best concentration to induced the highest number of somatic embryo in all explant types, with the most responsive explant was stem explant. Three lines (#23, #25, and #29) of P. amabilis transgenic plants showed the highest expression of AtRKD4 and produced the highest number of somatic embryos. Transcriptomic analysis using RNA-sequencing in P. amabilis transgenic samples showed that as many as 118 genes upregulated and 36 genes downregulated after 7 days of induction with Dex. Upregulated genes were involved in developmental process, whilst, downregulated genes were involved in differentiation processes. PRKD gene was successfully induce somatic embryo formation in Arabidopsis plants. This research is usefull to be a reference for effective orchid clonal propagation through the use of PGR (TDZ and NAA) and genetic transformation via AtRKD4 and PRKD gene insertion. The data obtained from this research can enrich orchid transcriptome database useful as a base propagation of orchids.

Kata Kunci : Embriogenesis somatik, zat pengatur tumbuh, AtRKD4, RNA-sequencing, homolog RKD