PENYISIPAN GEN CBHA DARI Aspergillus niger PADA VEKTOR EKSPRESI YEAST SEBAGAI TAHAPAN PEMBENTUKAN STRAIN PENGHASIL ETANOL SELULOSA

Suci Aulia Ratu Fajrin, Dr. Endah Retnaningrum, S.Si., M.Eng.

2019 | Skripsi | S1 BIOLOGI

Produksi etanol selulosa sebagai energi alternatif membutuhkan enzim selulase untuk proses degradasi selulosa. Aktivitas enzim selulase terdapat pada beberapa mikrobia, salah satunya Aspergillus niger. Degradasi selulosa oleh mikrobia membutuhkan tiga jenis enzim yang bekerja secara sinergis, yaitu endoglukanase, eksoglukanase (Cellobiohydrolase/CBH), dan beta-glukosidase. Produksi etanol selulosa dapat dilakukan dengan memanfaatkan teknik DNA rekombinan, yaitu dengan membentuk suatu strain yang memiliki aktivitas selulolitik yang mampu mendegradasi selulosa menjadi glukosa dan sekaligus memproduksi etanol. Salah satu aplikasi teknik DNA rekombinan adalah penyisipan gen (kloning gen). Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi gen CBHA dari Aspergillus niger dan mengetahui hasil penyisipan gen CBHA pada vektor ekspresi yeast (pWYH257). RNA total diisolasi dari Aspergillus niger dan dijadikan template untuk memperoleh cDNA dengan teknik RT-PCR. Amplifikasi gen CBHA dilakukan dengan teknik PCR menggunakan primer spesifik. Hasil amplifikasi gen divisualisasi menggunakan elektroforesis. Gen CBHA dijadikan sebagai insert dan disisipkan pada vektor ekspresi yeast, yaitu pWYH257. Pemotongan fragmen DNA vektor dan insert menggunakan enzim restriksi PstI dan SpeI. Proses ligasi dilakukan dengan bantuan T4 DNA ligase. Produk ligasi ditransformasi pada sel kompeten Escherichia coli DH10B dengan metode elektroporasi. Plasmid rekombinan sebagai hasil penyisipan gen dipurifikasi dan divisulisasi dengan elektroforesis. Untuk mengetahui keberhasilan penyisipan gen, dilakukan digesti enzim pada plasmid rekombinan. Hasil penelitian ini diperoleh adanya gen CBHA yang diisolasi dari Aspergillus niger dengan ukuran 1.514 bp. Penyisipan gen CBHA pada vektor ekspresi yeast (pWYH257) belum menghasilkan plasmid rekombinan.

Cellulosic ethanol production as alternative energy requires cellulase enzyme in cellulose degradation process. Several microorganisms have cellulase enzyme activity, one of them is Aspergillus niger. Cellulose degradation require three kinds of cellulase enzyme, they are endoglucanase, exoglucanase (cellobiohydrolase/CBH), and beta-glucosidase. Cellulosic ethanol production can utilize recombinant DNA technique, which is forming a strain that has cellulolytic activity and can hydrolyze cellulose to glucose, also can produce ethanol. One of the application of recombinant DNA technology is gene cloning. This research aims to isolate the CBHA gene from Aspergillus niger and find out the result of CBHA gene cloning into yeast expression vector (pWYH257). The total RNA was isolated from Aspergillus niger and made as a template to obtain cDNA by RT-PCR. The amplification of CBHA gene was carried out using the PCR and specific primer and visualized by electrophoresis. The CBHA gene inserted into pWYH257. DNA fragments cleaved by PstI and SpeI restriction enzymes. T4 DNA ligase was used for connecting DNA fragments. Ligation products were transformed into E. coli DH10B competent cells using the electroporation method. The recombinant plasmid purified and visualized using electrophoresis. The digestion enzyme on the recombinant plasmid was used to determine the success of gene cloning. Based on this research, CBHA gene can be isolated from Aspergillus niger and show 1,514 bp in size. The CBHA gene cloning to pWYH257 has not produced recombinant plasmid.

Kata Kunci : plasmid rekombinan, RNA, RT-PCR, enzim restriksi.