INDUKSI EMBRIOGENESIS SOMATIK PADA ANGGREK Dendrobium phalaenopsis Fitzg. DENGAN PENYISIPAN GEN AtRKD4

NINTYA SETIARI, Dr. Endang Semiarti, M.S., M.Sc.; Prof. Sukarti Moeljopawiro, M.App.Sc.Ph.D ; Dr. Ir. Aziz Purwantoro, M.Sc.

2018 | Disertasi | DOKTOR BIOLOGI

Anggrek D. phalaenopsis Fitzg. adalah salah satu anggrek spesies asli Indonesia yang termasuk anggrek langka. Usaha perbanyakan tanaman anggrek tersebut perlu dilakukan untuk konservasi maupun pemenuhan kebutuhan komersial, baik secara konvensional maupun moderen, antara lain dengan teknik embriogenesis in vitro baik secara zigotik maupun somatik. Embriogenesis zigotik dilakukan dengan perkecambahan biji anggrek pada medium yang sesuai dan embriogenesis somatik dengan transformasi genetik pada protokorm dengan gen embrio AtRKD4. Tujuan penelitian ini adalah 1. Mempelajari pertumbuhan dan perkembangan embrio biji anggrek D. phalaenopsis pada medium kultur in vitro yang ditambah pepton sebagai suplemen organik. 2. Menganalisis kecepatan pertumbuhan dan perkembangan embrio biji anggrek D. phalaenopsis pada kultur in vitro, 3. Mendapatkan persentase frekuensi transformasi genetik protokorm dengan gen 35S::GR::AtRKD4, 4. Mengetahui ekspresi transgen 35S::GR::AtRKD4 dan menganalisis fungsi gen tersebut terhadap karakter fenotip anggrek D. phalaenopsis dan 5. Menentukan konsentrasi Dexamethasone (DEX) yang optimum untuk menginduksi pembentukan embrio somatik pada protokorm transforman anggrek D. phalaenopsis pembawa 35S::GR::AtRKD4. Tahapan penelitian yang dilakukan adalah perkecambahan biji anggrek pada media dasar (VW) dan media VW ditambah pepton (0, 1, 2, 3 gr/L), transformasi genetik protokorm dengan gen 35S::GR::AtRKD4 melalui A. tumefaciens EHA 105 dan induksi pembentukan embrio somatik pada protokorm transforman anggrek D. phalaenopsis pembawa 35S::GR::AtRKD4 dengan DEX (0, 10, 15, 20 µM) pada media VW atau NP selama 1 atau 2 minggu. Hasil pengamatan menunjukkan bahwa pertumbuhan dan perkembangan embrio biji anggrek D. phalaenopsis mencapai optimal (93,93%) pada medium VW ditambah pepton 2 gr/L (VWP2) dibandingkan perkecambahan pada medium dasar VW (87,26%). Pada medium VWP2, embrio mencapai fase 6 pada minggu ke-8 setelah tanam, warna embrio hijau dan embrio berukuran lebih besar dibanding perlakuan lain. Hasil transformasi genetik protokorm dengan gen 35S::GR::AtRKD4 menunjukkan frekuensi transformasi genetik 12,10%. Deteksi integrasi gen AtRKD4 pada genom kandidat transforman pembawa gen AtRKD4 membuktikan bahwa terdapat integrasi gen AtRKD4 pada genom anggrek dengan teramplifikasinya fragmen DNA dengan ukuran 382 bp dengan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) menggunakan primer AtRKD4. Induksi pembentukan embrio somatik pada protokorm pembawa gen 35S::GR::AtRKD4 dengan DEX menghasilkan pembentukan tunas terbanyak (27 + 6) buah pada tiap protokorm yang diinduksi dengan DEX 15 µM selama 2 minggu pada media NP. Pada media VW, tunas terbanyak (17 + 6) buah pada tiap protokorm yang diinduksi dengan DEX 20 µM selama satu minggu. Hasil pengamatan anatomi embrio somatik yang terbentuk pada protokorm pembawa gen 35S::GR::AtRKD4 menunjukkan bahwa embrio somatik tersusun dari sel yang berukuran lebih kecil daripada sel protokorm induk dan mempunyai nukleus besar. Hasil RT-PCR pada uji ekspresi gen AtRKD4 pada protokorm yang membentuk embrio somatik menunjukkan pita cDNA hasil transkripsi gen AtRKD4 yang berukuran 382 bp. Berdasarkan hasil penelitian yang diperoleh dapat disimpulkan bahwa perbanyakan tanaman anggrek D. phalaenopsis dapat dioptimalkan dengan transformasi genetik protokorm anggrek dengan gen embrio AtRKD4 yang menghasilkan rata-rata 15 tanaman dari 1 protokorm dan total tanaman yang dihasilkan dari penelitian ini adalah 1840 tanaman dari 126 protokorm.

D. phalaenopsis Fitzg. orchid is one of the native orchid species of Indonesia that decided as rare orchids. For the conservation as well as the compliance of commercial requirement, it is needed to do effort of both conventionally and modern orchid plant propagation, among others by in vitro technique either zygotic and somatic embryogenesis. Zygotic embryogenesis was performed by germination of orchid seed on a suitable medium and somatic embryogenesis through genetic transformation of protocorm by using AtRKD4 embryonic genes. The objectives of this research are: 1) To study the growth and development of D. phalaenopsis orchid seed embryos in an in vitro culture medium supplemented with peptone as an organic supplement; 2) To analyzing the growth rate and development of D. phalaenopsis embryo in in vitro culture; 3) To obtain the frequency of genetic transformation of protocorm by using 35S::GR::AtRKD4 genes; 4) To clarify the function of 35S::GR::AtRKD4 on D. phalaenopsis transgenic and 5) To determine the optimum concentration of Dexamethasone (DEX) for inducing somatic embryo formation in 35S::GR::AtRKD4 containing D. phalaenopsis orchid protocorms. The experiment were conducted in 2 steps: germination of orchid seed on VW basic media and VW media plus pepton (0, 1, 2, 3 gr/L), genetic transformation of protocorm with 35S::GR::AtRKD4 gene via A. tumefaciens strain EHA 105 and induction of somatic embryo formation in protocorm of 35S::GR::AtRKD4 containing D. phalaenopsis by using DEX (0, 10, 15, 20 uM) on VW or NP medium for 1 or 2 weeks. The results showed that the optimum growth and development of D. phalaenopsis orchid embryo (93,93%) reached on VW medium plus 2 grL-1 pepton (VWP2) compared to that of germination on VW basic medium which only reached 87,26%. In VWP2 medium, the phase 6 embryo was achieved at 8th week after plantation, the colors of embryo were green and the size was larger than other treatments. The result of genetic transformation on protocorm by using the 35S::GR::AtRKD4 gene showed the genetic transformation frequency of 12.10%. The detection of AtRKD4 gene integration in the AtRKD4 gene containing transformant candidate genom proved that there is integration of AtRKD4 gene in the orchid genome with the amplification of 382 bp DNA fragment with AtRKD4 primers. Induction of somatic embryo formation in 35S::GR::AtRKD4 gene containing protocorm by using DEX resulted in the formation of (27 + 6) buds in each protocorm after its being induced by 15 uM DEX for 2 weeks on NP medium. In VW medium, (17 + 6) buds were formed on each protocorm after being induced by 20 uM DEX for one week. Anatomic observations of somatic embryo derived from 35S::GR::AtRKD4 gene containing protocorms showed that somatic embryos were composed of cells that smaller than that in the parent protocorm cells on size with larger nuclei. The results of RT-PCR the expression transgene AtRKD4 test on protocorm that forms a somatic embryo can be detected that a cDNA band of AtRKD4 gene with 382 bp in size. Taken together, it can be concluded that the propagation of D. phalaenopsis orchid plants can be optimized improved by using genetic transformation of orchid protocorm with embryonic gene AtRKD4, that finally can be produced 15 intact plants from one protocorm and totally can be produced 1840 plants from this research.

Kata Kunci : embriogenesis, AtRKD4, Dendrobium phalaenopsis, pepton, dexamethasone