Deteksi Mutasi Cd 26 (G->A) Gen Pengkode Beta-Globin pada Pembawa HbE dengan Metode High Resolution Melting Analysis

AHMAD AL ARIF, Dr. Niken Satuti Nur Handayani, M.Sc.

2018 | Skripsi | S1 BIOLOGI

HbE merupakan varian struktur hemoglobin yang disebabkan oleh subsitusi basa G->A pada kodon 26 gen pengkode beta-globin sehingga terjadi perubahan asam amino glutamat menjadi lisin. Kelainan ini bersifat autosomal resesif dan dapat terwariskan pada keturunan. Pembawa HbE tidak menunjukkan abnormalitas klinis, tetapi secara hematologis terjadi penurunan nilai MCV maupun MCH dan peningkatan nilai HbA2. Hasil analisis hematologis perlu dilanjutkan dengan analisis molekular. Konfirmasi secara molekular penting untuk melengkapi data hematologis. High resolution melting analysis (HRMA) merupakan suatu metode deteksi mutasi yang bersifat cepat dan menghasilkan data yang akurat dengan biaya operasional yang murah. Penelitian ini bertujuan untuk mendeteksi mutasi Cd 26 (G->A) gen pengkode beta-globin pada pembawa HbE menggunakan HRMA. Sampel DNA diisolasi dari arsip koleksi darah pembawa HbE dan HbE/beta-thalassemia melalui empat tahapan mencakup lisis sel, pengikatan, pencucian, dan elusi. DNA hasil isolasi dikualifikasi dengan elektroforesis gel agarosa dan dikuantifikasi dengan metode spektrofotometri. Analisis DNA untuk deteksi mutasi dilakukan dengan HRMA pada instrumen real time PCR. Data hasil deteksi HRMA dianalisis dengan high resolution melt software v3.1. Hasil penelitian menunjukkan bahwa aligned melt curve sampel normal lebih tinggi dibandingkan sampel mutan dan difference plot sampel membentuk dua kelompok varian. Mutasi Cd 26 (G->A) terdeteksi sebesar 86% dari dua puluh satu sampel. Terdapat tiga sampel yang berdasarkan analisis hematologis positif sebagai pembawa HbE, namun hasil HRMA tidak menunjukkan adanya mutasi tersebut.

HbE is a variant hemoglobinopathy caused by base substitution G->A at codon 26 in the beta-globin coding gene which ensue the alteration of glutamic acid for lysine. It is autosomal recessive disorder and may inherited to offspring. HbE carriers clinically do not exhibit abnormalities, but hematologically occur reduction of MCV and MCH, whereas increase of HbA2. Result of hematological analysis should be continued to molecular analysis. Molecular confirmation is important to adjust the hematological data. High resolution melting analysis (HRMA) is a rapid and high-throughput method for mutation detection with low operational cost. The aim of this research was to detect Cd 26 (G->A) mutation in the beta-globin coding gene of HbE carriers using HRMA. Samples of DNA were isolated from blood archive collection of HbE and HbE/beta-thalassemia carriers with four steps included cell lysis, binding, washing, and elution. The DNA isolation results were qualificated with agarose gel electrophoresis and quantificated with spectrophotometric method. The DNA analysis for mutation detection was performed with HRMA on real time PCR instrument. High resolution melt software v3.1 was used to analyze HRMA result. The result showed that the aligned melt curve of normal samples were higher than mutant samples and the difference plot formed two groups of variant. The Cd 26 (G->A) mutation was detected in the amount of 86% from twenty one samples. There were three samples which hematologically positive as HbE carriers, but HRMA result did not show the existence of mutation.

Kata Kunci : HbE, mutasi Cd 26 (G->A), high resolution melting analysis, aligned melt curve, difference plot