ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA PENANGKAP RADIKAL DPPH (2,2-DIFENIL-1-PIKRILHIDRAZIL) DAN IMUNOMODULATOR IN VITRO DARI BUAH KOPI HIJAU (Coffea canephora Pierre ex A. Froehner)

ISNINDAR, Prof. Dr. Subagus Wahyuono, M.Sc., Apt.; drh. Sitarina Widyarini, M.P., PhD.; Prof. Dr. Ediati Sasmito, S.E., Apt.

2018 | Disertasi | S3 Ilmu Farmasi

Buah kopi hijau (Coffea canephora Pierre ex A. Froehner) dari suku Rubiaceae, mengandung kafein, sitosterin, terpenoid, senyawa fenolik dan asam klorogenat yang telah dilaporkan memiliki potensi antioksidan dan merangsang sistem imun. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui senyawa aktif yang bertanggung jawab terhadap aktivitas penangkap radikal bebas DPPH dan imunomodulator serta mengetahui aktivitas senyawa aktif dari buah kopi hijau sebagai penangkap radikal bebas dan imunomodulator secara in vitro melalui parameter aktivitas fagositasi makrofag dan proliferasi limfosit. Ekstrak kloroform buah kopi hijau diperoleh dari penyarian maserasi. Hasil ekstrak kloroform ditambahkan dengan fase gerak metanol 80% untuk menghasilkan fraksi larut metanol 80% dan fraksi tidak larut metanol 80%. Isolat 1 diperoleh dari fraksi larut metanol 80% yang dikromatografi cair vakum (KCV) dengan fase gerak kloroform dan dikromatografi lapis tipis preparatif (KLTP) dengan fase gerak kloroform:etilasetat (1:3 v/v). Isolat 2 diperoleh dari fraksi larut metanol 80% yang dianalisis secara KCV sebanyak dua kali, masing-masing dengan fase gerak yang berbeda yaitu kloroform dan heksan:etilasetat (3:1 v/v), selanjutnya dianalisis secara KLTP dengan fase gerak heksan:etilasetat (3:1v/v). Sedangkan Isolat 3 diperoleh dari fraksi tidak larut metanol 80% yang dipisahkan secara kromatografi kolom dan dianalisis secara KLTP dengan fase gerak kloroform:etilasetat (15:1v/v). Masing-masing isolat dianalisis, diuji aktivitas penangkap radikal DPPH dan imunomodulator. Analisis dengan beberapa metode seperti kromatografi lapis tipis (KLT) menggunakan standar kafein, stigmasterol dan 3 fase gerak, uji titik lebur, spektrofotometer UV-Vis, FT-IR, GC-MS dan NMR. Selanjutnya isolat diuji in vitro menggunakan metode penangkap radikal DPPH dan aktivitas imunomodulator melalui parameter kapasitas fagositasi dan proliferasi limfosit. Uji fagositasi makrofag dilakukan dengan kuantifikasi menggunakan metode lateks, sedangkan proliferasi limfosit dilakukan dengan metode MTT. Data yang diperoleh dianalisis secara statistik menggunakan program SPSS ANOVA. Hasil isolasi dan identifikasi senyawa aktif yang terkandung pada isolat 1 yaitu senyawa kafein, isolat 2 yaitu beta sitosterol, dan isolat 3 yaitu campuran senyawa stigmasterol dan beta sitosterol. Hasil pengujian aktivitas in vitro terhadap penangkap radikal DPPH dan imunomodulator diketahui isolat 1 memiliki IC50 sebesar 2,38 mg/mL, tidak memiliki aktivitas fagositasi makrofag tetapi memiliki aktivitas proliferasi limfosit. Isolat 2 memiliki IC50 sebesar 1,69 mg/mL, memiliki aktivitas fagositasi makrofag, dan memiliki aktivitas proliferasi limfosit. Isolat 3 memiliki IC50 sebesar 1,85 mg/mL, memiliki aktivitas fagositasi makrofag tetapi tidak berpengaruh terhadap aktivitas proliferasi limfosit.

Green coffee bean (Coffea canephora Pierre ex A. Froehner) of Rubiaceae family, contains natural substances such as caffeine, sitosterine, terpenoids, fenolic substance, chlorogenic acid, which has been reported possess antioxidant activity and stimulates immune system. The aim of this research was to define active substance that is responsible for DPPH free radical scavenging and immunomodulator, also evaluate the activity of active compounds of green coffee beans as free radical scavenging and immunomodulator by in vitro employing parameters of macrophage phagositosis activity and lymphocyte proliferation. Chloroform extract of green coffee bean was obtained from maceration extraction. Chloroform extract was added with 80% methanol as mobile phase resulting two phases that are 80% diluted methanol fraction and 80% undiluted methanol fraction. Isolat 1 was obtained from 80% diluted methanol fraction that was vacuum liquid chromatographed using chloroform mobile phase and preparative thin layer chromatographed using chloroform:ethyl acetate (1:3 v/v). Isolat 2 was derived from 80% diluted methanol fraction that was twice vacuum liquid chromatographed using mobile phase of chloroform:ethyl acetate and hexane:ethyl acetate (3:1 v/v), respectively. While, isolat 3 was obtained from 80% undiluted methanol fraction that was column chromatographed and preparative thin layer chromatographed using chloroform:ethyl acetate (15:1 v/v). Each isolat was analysed and assayed for DPPH free radical scavenging and immunomodulator. Isolats were identified by several methods such as thin layer chromatography (TLC) using a standard of caffein, stigmasterol, and 3 mobile phases, melting point test, UV-Vis spectrophotometry, FT-IR, GC-MS, and NMR. Isolat was then further confirmed for antioxidant activity by DPPH radical scavenging method and immunomodulator activity with fagositation capacity parameter and lymphocyte proliferation. Macrophage fagositation test was conducted by quantification using latex method. Lymphocyte proliferation test was done using MTT method. Data results were calculated using SPSS ANOVA statistics. Isolation and identification of active substances resulted isolat 1 containing caffein. Isolat 2 containing beta sitosterol, and isolat 3 containing stigmasterol and beta sitosterol mixture substance. The result of free radical scavenging of isolat 1 exhibited IC50 of 2.38 mg/mL and immunomodulator test showed that isolat 1 did not have macrophage activity and fagositation index, however it had limphocyte proliferation activity. Isolat 2 exhibited IC50 of 1.69 mg/mL and immunomodulator test showed that it has macrophage fagositation activity and limphocyte proliferation activity. Isolat 3 exhibited IC50 of 1.85 mg/mL and immunomodulator test showed that isolat 3 had macrophage fagositation activity and had no limphocyte proliferation activity.

Kata Kunci : buah kopi, kafein, beta sitosterol, stigmasterol, DPPH, imunomodulator