DETEKSI PROTEIN A DAN ANALISIS GEN PENYANDI PROTEIN A (spa) Staphylococcus aureus ISOLAT SUSU SERTA PERANNYA SEBAGAI ANTIFAGOSIT OLEH SEL POLIMORFONUKLEAR

GUNO, Bagus Brahmanto Aji , A. E. T. H. Wahyuni

2014 | Tesis |

Patogenesitas Staphylococcus aureus dalam mastitis sangat dipengaruhi oleh protein permukaan dan salah satu yang terbanyak adalah protein A. Protein A memiliki peran sebagai faktor antifagositosis dengan mengikat reseptor Fc dari imunoglobulin G (IgG) sehingga mampu menurunkan sistem imun hospes. Protein A disandi oleh gen spa. Tujuan dari penelitian ini untuk menemukan kesesuaian antara deteksi keberadaan protein A dengan serum soft agar (SSA) terhadap deteksi gen spa secara PCR; menganalisis gen spa dan membuktikan adanya hubungan keberadaan dan jumlah tandem repeat di dalam gen spa terhadap respon antifagositosis oleh sel PMN; menentukan keragaman genetik gen spa isolat S. aureus asal susu di Boyolali, Pacitan dan Ponorogo berdasarkan sekuensing gen spa hasil PCR. Sebanyak 34 isolat S. aureus asal susu di Boyolali, Pacitan dan Ponorogo, serta 1 isolat referensi yaitu S. aureus strain Cowan I dilakukan identifikasi ulang dengan mengkultur pada plat agar darah (PAD), pengecatan Gram, uji katalase, uji koagulase, Mannitol Salt Agar (MSA) dan uji voges proskauer (VP). Pengujian keberadaan protein A dengan serum soft agar (SSA). Pengujian kapasitas fagositosis in vitro dilakukan dengan mereaksikan sel PMN dengan isolat bakteri yang telah mengalami opsonisasi. Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk mengidentifikasi S. aureus dengan deteksi gen 23S rRNA menggunakan primer spesifik dengan produk 1250 bp dan deteksi gen spa menggunakan primer spesifik dengan produk 685 bp. Analisis sekuensing gen spa dengan software Mega 5.1. untuk melihat adanya tandem repeat dan hubungan kekerabatan antar isolat. Analisis statistik menggunakan uji Mann-Whitney dan analisis kesesuaian dua uji menggunakan Kappa. Identifikasi ulang menunjukkan bahwa 32 dari 34 isolat S. aureus asal Boyolali, Pacitan dan Ponorogo, serta 1 isolat referensi strain Cowan I teridentifikasi sebagai S. aureus. Deteksi protein A menggunakan SSA menghasilkan kelompok koloni kompak (81,25%) yang terfagosit lebih sedikit secara signifikan (P<0,05) daripada kelompok difus (6,25%). Sebanyak 71,9% isolat memiliki kesesuaian antara deteksi protein A menggunakan SSA dengan deteksi gen spa secara PCR. Kapasitas fagositosis antara isolat yang positif dan negatif gen spa tidak berbeda signifikan (P>0,05). Analisis hasil sekuensing gen spa menunjukkan adanya jumlah tandem repeat yang tinggi di dalam gen spa mengakibatkan peningkatan mekanisme antifagositosis sehingga lebih patogen.

Pathogenicity of S. aureus in mastitis is strongly influenced by the presence of surface proteins and one of the most is protein A. Protein A has a role as an anti-phagocytic factor by binding to Fc receptors of immunoglobulin G (IgG) so as to decrease the host immune system. Protein A encoded by the spa gene. The purpose of this research is to find the compability between the detection of the presence of protein A in serum soft agar (SSA) to the spa gene detection by PCR; analyze spa gene and prove the relationship of the existence and the number tandem repeat in the spa gene to the anti-phagocytic response by polymorphonuclear cells; determine the genetic diversity of S. aureus isolates from milk in Boyolali, Pacitan and Ponorogo based on sequencing of the spa gene PCR results. A total of 34 isolates of S. aureus from milk in Boyolali, Pacitan and Ponorogo, also1 reference isolate of S. aureus strain Cowan I was re-identificated by culturing S. aureus on Blood Agar Plates (BAP), Gram staining, catalase test, coagulase test, Mannitol Salt Agar (MSA) and Voges Proskauer test (VP). Testing the presence of protein A use serum soft agar (SSA). In vitro phagocytic capacity test performed by reacting PMN cells with bacterial isolates that have undergone opsonization. Polymerase Chain Reaction (PCR) to identify S. aureus by detection of 23S rRNA gene using specific primers with a product size of 1250 bp and the detection of spa gene using specific primers with a product size of 685 bp. Analysis sequencing of spa gene using Mega 5.1. software for the presence of tandem repeat and kinship relationships between isolates. Statistical analysis using the Mann-Whitney test and analysis of two test suitability using Kappa. Conventional and molecular reidentification showed that 32 of 34 isolates of S. aureus from Boyolali, Pacitan and Ponorogo, also 1 reference isolates strain Cowan I identified as pure S. aureus. Detection of protein A using the SSA produces a compact colony group (81.25%) that were significantly (P <0.05) less in phagocytic number than the diffuse colony group (6.25%). There are 71,9% isolates have compatibility between detection protein A using the SSA with the detection of spa gene using PCR. Phagocytic capacity between positive and negative isolates of spa gene did not differ significantly (P>0,05). Analysis sequencing of the spa gene showed a high number of tandem repeat in the spa gene resulted in increased of anti-phagocytic response so that making it more pathogenic.

Kata Kunci : Staphylococcus aureus, protein A, spa, antifagositosis, tandem repeat