Penentuan Tipe dan Subtipe Virus Avian Influenza dengan Metode Single Step Multiplex RT-PCR dan Studi Filogenetik Isolat Virus Asal Nanggroe Aceh Darussalam (NAD)

HELMI, Teuku Zahrial, Rini Widayanti

2010 | Tesis |

It has conducted a research on the Avian Influenza Virus (AIV) derived from the region of Aceh. The aims of this research is to identify the presence of M, H5 and N1 genes AI virus by single-step multiplex RT-PCR method, as a reference for validation of molecular diagnostic AIV in Nanggroe Aceh Darussalam (NAD) Province and to analyse phylogenetically of AI virus isolates from NAD Province. This research used 11 AI virus isolates from several regions in NAD province which collected from BPPV Regional I Medan during 2007 to 2008. Research was conducted at the Virology Laboratory of Investigation and Testing Center of Veterinary (BPPV) Regional I Medan. Amplification of the matrix gene (M) AI virus using Simplex method RT-PCR was performed on 11 isolates of AI virus. Results of Simplex RT-PCR for M gene showed that only 10 isolates generated DNA bands 276 bp, and 1 isolate do not appear, then 10 isolate were further amplified by Single Step Multiplex RT-PCR using primer set of encoding genes for M, H5 and N1. RT-PCR products of all 10 isolates showed that multi DNA bands generated 131 bp for N1 gene, 189 bp for H5 gene and 276 bp for M gene respectivelly. Five AI virus isolates representing from 5 districts of samples origin for DNA were sequenced on H5 gene. sequencing datas were analyzed using MEGA 4.0 program. It know that primer attachment is located on base position number 1372for forward primer on 1562 for reverse primer, which generated for 191 nucleotides. The alignment of the 191 nucleotides that encode 63 amino acids in position 458th to 520 th found 5 aa variation (493th, 498th, 499th, 504th and 515th position) in compare test between tests isolates with reference isolates from genbank. Phylogenetic analysis of genetic distance values obtained 0-11% with mean of 3%. The value of genetic distance among isolates tested is 0%. Phylogenetic tree construction showed that all of AI virus isolates sub-type H5N1 form 2ed a separate clusters. The first cluster of AI virus H5N1 sub-type from Indonesia an the second cluster is AI virus H5N1 sub-type of Asian origin. AI virus H5N1 sub-type of test isolates clustered separately from the other Indonesian isolates, but still within the cluster AI virus H5N1 sub-type of Indonesia. Keywords: Avian Influenza; Single Step RT-PCR; sequencing.

Telah dilakukan penelitian terhadap virus Avian Influenza (AI) yang berasal dari daerah Nanggroe Aceh Darussalam. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi keberadaan gen M, H5 dan N1 virus AI melalui metode single step multiplex RT-PCR, sebagai acuan untuk peneguhan diagnosa secara molekuler virus AI di Provinsi Nanggroe Aceh Darussalam (NAD) dan untuk studi filogenetik virus AI asal Provinsi NAD. Penelitian ini menggunakan 11 isolat virus AI asal Provinsi NAD yang diperoleh dari laboratorium BPPV Regional I Medan di Sumatera Utara dari tahun 2007 sampai 2008. Penelitian dilakukan di Laboratorium Virologi Balai Penyidikan dan Pengujian Veteriner (BPPV) Regional I di Medan, Sumatera Utara. Amplifikasi terhadap gen matriks (M) virus AI menggunakan metode Simplex RT-PCR dilakukan pada 11 isolat virus AI. Hasil Simplex RT-PCR terhadap gen M diperoleh 10 isolat yang menunjukkan pita DNA (band) pada 276 bp dan satu isolat yang tidak muncul, kemudian dilanjutkan dengan metode Single Step Multiplex RT-PCR menggunakan pasangan primer gen penyandi protein M, H5 dan N1. Produk PCR setelah dielektroforesis dan diperoleh hasil semua (ke sepuluh) isolat virus AI muncul band masing-masing 131 bp (N1), 189 bp (H5) dan 276 bp (M). Hasil amplifikasi gen H5, N1 dan M dengan metode Single Step Multiplex RT-PCR diambil 5 isolat virus AI mewakili 5 kabupaten asal sampel untuk dilakukan sekuensing DNA terhadap gen HA (H5). Untuk melakukan sekuensing ke 5 sampel tersebut terlebih dahulu dilakukan amplifikasi gen H5 dengan primer yg spesifik, sampel dikirim dalam bentuk cDNA. Data hasil sekuensing dianalisis dengan menggunakan program MEGA 4.0. Analisa hasil sekuensing diketahui bahwa penempelan primer terletak pada posisi basa ke 1372 untuk primer forward dan pada posisi ke 1562 untuk primer reverse dengan daerah yang teramplifikasi sebesar 191 bp. Penjajaran ke 191 nukleotida yang menyandi 63 asam amino (aa) pada posisi ke 458 sampai aa ke 520), ditemukan 5 aa beragam (posisi ke 493, 498, 499, 504 dan posisi ke 515) antara isolat uji dengan isolat dari pembanding dari gen bank. Analisis filogenetik diperoleh nilai jarak genetik antara isolat uji dengan isolat pembanding adalah berkisar antara 0-11 % dengan rata-rata 3%, dan nilai jarak genetik antara sesama isolat uji 0 %. Kontruksi pohon filogenetik menunjukkan semua isolat virus AI sub tipe H5N1 membentuk 2 klaster terpisah, yaitu klaster pertama virus AI sub tipe H5N1 asal Indonesia dan klaster kedua yang merupakan virus AI sub tipe H5N1 asal Asia. Virus AI sub tipe H5N1 isolat uji mengelompok secara terpisah dari isolat Indonesia yang lain, tetapi masih dalam klaster virus AI sub tipe H5N1 Indonesia. Kata Kunci: Avian Influenza; Single Step RT-PCR; Sekuensing.

Kata Kunci : Avian Influenza; Single Step RT-PCR; sequencing