PERANCANGAN PRIMER UNTUK DETEKSI Fusarium oxysporum f. sp. cubense RAS 4 TROPIKA BERDASARKAN SEKUEN IGS REGION DENGAN METODE PCR-RFLP

Yudha Pratama, Dr. Ir. Arif Wibowo, M.Agr.Sc; Dr. Ani Widiastuti, S.P., M.P.

2017 | Tesis | S2 Fitopatologi

Fusarium oxysporum f. sp. cubense ras 4 tropika (Foc TR4) yang termasuk ke dalam kelompok VCG 01213 saat ini menjadi perhatian utama dalam kendala produksi tanaman pisang di berbagai negara. Validasi primer spesifik berbasis PCR menggunakan kontrol positif (Foc TR4). Total, 50 isolat Foc dikoleksi dari beberapa daerah produksi pisang di Indonesia mewakili kultivar, genotipe dan VCG yang dikonfirmasi sebagai isolat Foc berdasarkan pengujian menggunakan primer FocEf3, kecuali isolat Cjr-2 dan Lmp-4. Foc-1/Foc-2 dapat mengamplifikasi 34 isolat Foc yang termasuk ke dalam Foc ras 4. Selanjutnya tiga pasang primer spesifik yaitu TR4-F/TR4-R, Six-1c, dan TR4-F2/TR4-R1 digunakan untuk mengelompokkan isolat-isolat tersebut ke dalam isolat Foc ras 4 tropika. TR4-F/TR4-R diketahui memiliki spesifisitas tertinggi karena dapat mengamplifikasi sebanyak 35 isolat Foc termasuk kontrol positif (Foc TR4) dibandingkan dengan primer lainnya (Six-1c dan TR4-F2/TR4-R1). Hasil desain primer FocUGM-F/FocUGM-R yang diperoleh dari sekuen isolat Foc TR4 asal Indonesia berdasarkan IGS region tidak dapat membedakan isolat-isolat Foc TR4 dengan isolat Foc ras 1 yang digunakan sebagai kontrol dalam penelitian ini. Pada sekuen isolat Foc TR4 berdasarkan IGS region ditemukan situs pemotongan enzim restriksi BamHI pada situs pemotongan 346 bp tetapi tidak ditemukan pada sekuen isolat Foc ras lainnya (Foc ras 1, ras 2, maupun ras 4 subtropika). Pengujian dengan metode PCR-RFLP dapat menentukan isolat-isolat Foc TR4 (VCG 01213/16) dan pada isolat-isolat Foc yang belum diketahui atau tidak kompatibel pada seluruh kelompok VCG, yaitu dengan melihat terpotong atau tidaknya isolat-isolat Foc menggunakan enzim restriksi tersebut. Isolat-isolat yang terpotong menggunakan metode PCR-RFLP dapat dikelompokkan ke dalam Foc TR4. Penelitian ini menunjukkan bahwa terdapat sejumlah besar keragaman strain yang terlihat pada isolat-isolat Foc tersebut untuk dapat dipelajari lebih lanjut. Ras 4 dari Foc (STR4 atau TR4) diketahui tersebar luas pada beberapa daerah di Indonesia. Oleh karena itu, perlu dilakukan pengembangan primer spesifik untuk mendeteksi Foc TR4 dan strain yang paling merusak pada Foc TR4 berdasarkan data molekuler.

Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropic race 4 (Foc TR4) which belong to the group of VCG 01213 is currently a major concern within the constraints of the banana crop production in many countries. Validation of specific primer pairs using the positive control (Foc TR4). In total, 50 isolates of Foc were collected from several banana production regions in Indonesia represent the group of VCG, races, genotype, cultivars, were confirmed as Foc based on the tested using FocEf3 primer pair, except Cjr-2 and Lmp-4 isolates. Foc-1/Foc-2 could amplify 34 Foc isolates included in Foc race 4. Three specific primer pairs i.e. TR4-F/TR4-R, Six-1c, and TR4-F2/TR4-R1 were used to classify the Foc isolates into Foc race 4 tropic. TR4-F/TR4-R is known have the highest specificity as it could amplify 35 Foc isolates including positive controls (Foc TR4) compared to the other primer pairs (Six-1c and TR4-F2/TR4-R1). Results of primer design FocUGM-F/FocUGM-R derived from the Foc TR4 sequence originated from Indonesia based on the IGS region unable to differentiate Foc TR4 and Foc race 1 isolates that were used as control in this study. In Foc TR4 sequence based on the IGS region was found BamHI restriction enzyme cutting site on 346 bp, but were not found in the other races of Foc (Foc race 1, race 2, or subtropic race 4). By PCR-RFLP method can determine Foc TR4 (VCG 01213/16) and unknown or incompatible Foc on a whole group of VCG by the cutting site using the restriction enzyme. The isolates that were cut using PCR-RFLP method can be grouped into Foc TR4. This research indicates that there are a large number of diversity strains seen in Foc isolates to be studied for further research. Race 4 of Foc (STR4 or TR4) was known to be widespread in several regions in Indonesia. Therefore, specific primer pair development needs to be done to detect Foc TR4 and the most damaging strains on Foc TR4 based on molecular data.

Kata Kunci : Fusarium oxysporum f. sp. cubense, specific primer, design primer, restriction enzyme, PCR-RFLP