DETEKSI DAN IDENTIFIKASI MOLEKULER INTERNAL TRANSRIBED SPACER 1 PADA Trypanosoma evansi

EDI WIDODO, Dr.drh.R.Wisnu Nurcahyo;Dr.drh.S.Indarjulianto

2017 | Tesis | S2 Sain Veteriner

Trypanosomiasis (surra) merupakan penyakit pada sapi, kerbau, kuda dan unta yang disebabkan oleh Trypanosoma evansi dan ditularkan secara mekanik oleh lalat penghisap darah. Surra menyebabkan kerugian ekonomi pada ternak, bersifat imunosupresif dan berpotensi menjadi penyakit zoonosis. Internal transcribed spacer 1 (ITS1) merupakan marker yang telah digunakan untuk deteksi dan identifikasi molekuler, analisis filogenetik, evaluasi proses evolusi dan penentuan taksonomi pada protozoa termasuk Trypanosoma sp di beberapa negara. Penelitian ini bertujuan untuk mendeteksi Trypanosoma evansi secara molekuler menggunakan marker ITS1 dan mengetahui variasi genetik ITS1 Trypanosoma evansi dari beberapa daerah di Indonesia. Sampel yang digunakan berjumlah 8 terdiri dari 1 isolat T. evansi (Brebes), 2 sampel darah mencit positif T. evansi (Hulu Sungai Utara dan Kotawaringin Timur), 1 sampel darah sapi positif CATT (Kulon Progo), 2 sampel darah kerbau positif HCT (Ngawi dan Purbalingga) dan 2 sampel DNA Sapi (Lampung dan Bengkulu). Deteksi molekuler menggunakan teknik polymerase chain reaction (PCR) pada region ITS-1 rDNA dengan menggunakan primer forward ( TGT AGG TGA ACC TGC AGC TGG ATC 3) dan primer reverse (CCA AGT CAT CCA TCG CGA CAC GTT 3). Semua sampel menunjukkan hasil PCR positif berukuran 400 bp kemudian disekuensing. Hasil sekuensing dianalisis menggunakan Basic Local Aligment Search Tool (BLAST) dan software Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) versi 7. Analisis BLAST menunjukkan bahwa sekuen ITS1 T. evansi semua sampel penelitian identik 96% - 100% dengan sekuen ITS-1 T. evansi di GenBank . Substitusi nukleotida sebanyak 35 nukleotida dan 1 insersi. Pohon filogenetik neighbor joining dan maximum parsimony berdasarkan sekuen ITS-1 T. evansi menunjukkan bahwa 8 sampel penelitian terbagi menjadi 3 kelompok. Kelompok pertama terdiri dari T. evansi asal Bengkulu, Lampung, Purbalingga dan T. evansi dari GenBank (Cina, Filipina, India dan Thailand). Kelompok kedua terdiri dari T. evansi asal Brebes, Kulon Progo, dan Ngawi. Kelompok ketiga terdiri dari T. evansi asal Hulu Sungai Utara dan Kotawaringin Timur. Internal Transcribed Spacer 1 dapat digunakan sebagai marker untuk deteksi molekuler T. evansi dan terdapat variasi genetik T. evansi berdasarkan ITS-1 rDNA. Hasil penelitian menunjukkan adanya variasi genetik internal transcribed spacer 1 (ITS-1) T. evansi di Indonesia.

Trypanosomiasis (surra) is a parasitic disease in animals caused by Trypanosoma evansi that is infected mechanicallly by haematophagous flies. Surra caused economic disadvantages in livestock, particularly horses, cows, and buffalos in Indonesia, in addition surra is immunosupresive and potential to be zoonotic disease. Internal transcribed spacer 1 (ITS-1) is a marker used to molecular detection, phylogenetic analysis, evaluate process of evolution and taxonomic identities of Trypanosoma sp in foreign countries. This study was conducted to detect Trypanosoma evance molecularly used the marker internal transcribed spacer-1 and know the genetic variation of ITS-1 T. evansi from several regions in Indonesia. There were 8 used samples consisting of 1 sample isolat of T. evansi (Brebes), 2 samples mice blood positive T. evansi (Hulu Sungai Utara, and Kotawaringin Timur), 1 sample cow blood positive CATT (Kulon Progo), 2 samples buffalo blood positive HCT (Ngawi and Purbalingga), and 2 samples DNA (Lampung and Bengkulu). The molecular detection used the technic of polymerase chain reaction (PCR) used forward primer (TGT AGG TGA ACC TGC AGC TGG ATC) and reverse primer (CCA AGT CAT CCA TCG CGA CAC GTT 3). The electrophoresis result of PCR was obtained amplicone of 400 bp, and then continued by sequencing. The sequencing result was analyzed by Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) and Molecular Evolutioniory Genetics Analysis (MEGA) version 7. BLAST analysis showed that the sequence of ITS-1 T. evansi from all samples was 96% - 100% identic with T. evansi sequence in GenBank. Thirty five nucleotida substitutions and one insertion were occurred. The construction of phylogenetic tree of neighbor joining and maximum parsimony based on ITS sequence showed that T. evansi divided into three groups. First group consist of T. evansi from Bengkulu, Lampung, Purbalingga together with T. evansi from GenBank (China, India, Phillipine and Thailand). Second group consist of T. evansi from Brebes, Kulon Progo and Ngawi. Third group consist of T. evansi from Hulu Sungai Utara dan Kotawaringin Timur. This research indicated clear evidence of existence of genetic diversity among T.evansi isolate from different geographical region in Indonesia.

Kata Kunci : BLAST,ITS1,MEGA,PCR,Trypanosoma evansi