STUDI ANALISIS KIMIA KUANTITATIF STEVIOSIDA DAN REBAUDIOSIDA A DAUN Stevia rebaudiana Bertoni DAN PRODUK SIMULASI MINUMAN STEVIA

YOHANES MARTONO, Prof. Dr. Sudibyo Martono, M.S., Apt.

2016 | Disertasi | S3 Ilmu Farmasi

Stevia rebaudiana mengandung senyawa aktif steviosida dan rebaudiosida A yang berpotensi sebagai kandidat obat antidiabetes tipe 2 dan telah dimanfaatkan untuk pemanis alami. Tujuan penelitian ini adalah mengembangkan metode analisis RP-HPLC isokratik beserta validasi metode dan aplikasinya untuk penetapan kadar kedua analit yang dituju dalam ekstrak etanolik daun S. rebaudiana dan produk simulasi minuman, mengembangkan metode preparasi sampel secara Solid Phase Extraction (SPE) baik fase terbalik maupun fase normal untuk analisis HPLC, melakukan studi degradasi senyawa analit secara hidrolisis, pemanasan kering dan paparan UV254 nm, dan mengembangkan metode analisis spektrofotometri FTIR yang dikombinasi dengan kalibrasi multivariat PLS untuk penetapan kadar steviosida dan rebaudiosida A dalam ekstrak etanolik kering daun S. rebaudiana dan produk simulasi minuman Stevia. Hasil penelitian menunjukkan kondisi optimal HPLC yang dikembangkan adalah fase diam Eurosphere C-18 (250 × 4,6 mm., i.d., 5 µm) pada suhu 30oC, fase gerak campuran akuades : metanol ( 90 : 10, v/v disesuaikan pH 3,00 dengan asam fosfat 0,1%) (pelarut A) dan asetonitril (pelarut B) dengan komposisi pelarut A : B = 65 : 35 (v/v) dan ditambahkan asam trifluoroasetat 0,01% (v/v), kecepatan alir 0,6 mL/min, detektor UV pada λ210 nm. Metode HPLC yang dikembangkan dapat memenuhi jaminan validasi metode dan berhasil diaplikasikan untuk penetapan kadar steviosida dan rebaudiosida A dalam sampel. Metode preparasi sampel SPE yang dikembangkan memenuhi jaminan akurasi dan presisi. Metode NP-SPE (silika) memiliki mekanisme selective elution sedangkan mekanisme metode RP-SPE (C-18) adalah selective washing. Degradasi steviosida dan rebaudiosida A ditunjukkan dengan terputusnya ikatan glikosida kedua analit. Metode RP-HPLC yang dikembangkan memiliki selektivitas yang baik (Rs > 2,0) terhadap senyawa hasil degradasi yang terdekat. Berdasarkan uji equivalence pair t test, metode analisis kuantitatif spektrofotometri FTIR yang dikombinasi dengan analisis multivariat PLS memberikan nilai prediksi yang equivalence dengan nilai aktual metode referens HPLC untuk penetapan kadar kedua analit dalam sampel.

Stevia rebaudiana leaf contain active compounds of stevioside and rebaudioside A which is potentially as type 2 antidiabetic drug candidate and has been used for a natural sweetener. The purposes of research were to develop isocratic RP-HPLC analysis method and to apply method developed for determining stevioside and rebaudioside A content in S. rebaudiana leaves and Stevia beverages simulation product, to develop Solid Phase Extraction (SPE) method, both of reverse (RP-SPE) (C-18) and normal phase (NP-SPE) (silica) followed by RP-HPLC analysis application, to conduct degradation study of stevioside and rebaudioside A, particularly using stressor of hydrolysis, thermal and UV 254 nm radiation, and to establish quantitative FTIR spectroscopy analysis method in combination with multivariate analysis using PLS regression to determine stevioside and rebaudioside A content in dried ethanol extract of S. rebaudiana leaf and Stevia beverages simulation product. The results showed that isocratic RP-HPLC analysis method was conducted on Eurosphere C-18 (250 × 4.6 mm, i.d., 5 µm) as stationary phase. Mobile phase was made by a mixture of water-methanol (90: 10, v / v, pH = 3.0) (solvent A) and acetonitrile (solvent B), in the ratio of A : B = 65: 35 (v/v) and was added by trifluoro acetic acid (TFA) of 0,01% (v/v) in to the mixture. Flow rate of mobile phase applied was 0.6 mL/min. The detection was performed in UV-210 nm. The method developed met completely in method validation and was successfully applied to determine stevioside and rebaudioside A content in sample. SPE methods developed achieve accuracy and precision assay. NP-SPE (silica) has selective elution mechanism to elute the analytes while RP-SPE (C-18) has selective washing mechanism. Stevioside and rebaudioside A degradation was performed by cleavage of glycoside bond. Isocratic RP-HPLC method developed still has good resolution (Rs > 2,00) of the analyte from nearest degradation compound. Based on equivalence pair t test analysis, quantitative FTIR spectroscopy method in combination with multivariate analysis of PLS was equivalence with reference method of HPLC to determine stevioside and rebaudioside A content in sample.

Kata Kunci : RP-HPLC isokratik, FTIR, steviosida, rebaudiosida A, Stevia rebaudiana