AMPLIFIKASI, SUBKLONING DAN SEKUENSING GEN PENYANDI PROTEIN INTERFERON GAMMA (IFN-γ) UNTUK PENGEMBANGAN DIAGNOSIS TUBERKULOSIS PADA ANJING

Mei Ita Riyanti, Prof. Dr. drh. Ida Tjahajati, M.P.

2012 | Tesis | S2 Sain Veteriner

Tuberkulosis adalah penyakit yang disebabkan oleh grup strain mikobakterium yang berhubungan dekat, seperti M.tuberculosis, M.bovis, M.africanum, dan M.microti yang biasa dikenal sebagai M.tuberculosis complex (MTC). Penyakit tuberkulosis (TB), terjadi pada manusia dan banyak spesies binatang. Tuberkulosis pada hewan kecil cukup mendapat perhatian karena penyakit ini dikhawatirkan dapat membahayakan kesehatan manusia. Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan diagnosa baru untuk identifikasi infeksi M.tuberculosis pada anjing, dengan cara subkloning gen penyandi protein interferon gamma. Protein interferon gamma yang dihasilkan dapat digunakan untuk pembuatan antibodi primer dan sekunder yang selanjutnya dapat dikembangkan dan digunakan untuk diagnosa tuberkulosis pada anjing dengan metode ELISA. Penelitian ini dimulai dengan amplifikasi gen IFN-γ dari mRNA yang didapat dari penelitian Tjahajati sebelumnya (2008) menjadi DNA menggunakan RT-PCR, kemudian diligasi ke vektor plasmid pET SUMO serta ditransformasi ke One Shot® Chemically Competent E. coli Mach 1 (One Shot® Mach1™-T1). Koloni yang tumbuh direkultur ke media Luria Bertani (LB) cair yang mengandung kanamycin dan selanjutnya diisolasi plasmidnya menggunakan High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche). Hasil isolasi plasmid diuji menggunakan PCR dengan primer canine IFN-γ anjing. Produk PCR kemudian disekuensing dan hasilnya dianalisa menggunakan MEGA versi 4.0. Hasil penelitian menunjukkan adanya koloni bakteri yang tumbuh dalam plat LB dan adanya pertumbuhan bakteri pada rekultur LB cair. Setelah dilakukan isolasi plasmid dan pengujian dengan PCR didapatkan hasil positif dengan adanya pita dengan panjang 541 bp pada hasil elektroforesis yang sesuai dengan panjang gen canine IFN-γ. Hasil sekuensing menunjukkan adanya kesamaan antara gen canine IFN-γ hasil kloning dengan gen canine IFN-γ dari Gene bank sebesar 91%.

Tuberculosis is a disease caused by close related Mycobacterium strains such as M.tuberculosis, M.bovis, M.africanum, and M.microti which are known as M.tuberculosis complex (MTC). Tuberculosis (TB) is mainly described by the presence of tubercle or granulomatous inflammation which could happen in human as well as many species of animals. Tuberculosis in small animal gains more attention because it can endanger human health. This research aims to develop a new diagnostic tool in identification of tuberculosis infection in dogs by subcloning of interferon gamma protein coding gene. Obtained interferon gamma protein can be used to produce primary and secondary antibodies which can be used in tuberculosis diagnosis in dogs by ELISA method. The research started by amplification of IFN-γ from mRNA obtained from Tjahajati’s research (2008) to DNA by RT-PCR. Obtained DNA were ligated to plasmid vector pET SUMO and transformed to One Shot® Chemically Competent E. coli Mach 1 (One Shot® Mach1™-T1). Growing colonies were recultured to liquid Luria Bertani (LB) media containing kanamycin. The next step is isolating plasmid using High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche). Isolated plasmids were tested using PCR with canine IFN-γ primer. Product of PCR than being sequenced and analysed with Mega version 4.0. The results showed that bacteria colonies successfully grown on LB plat media and grown in re-cultured liquid LB media. After plasmid isolation and PCR testing, positive results were marked by 541 bp band in electrophoresis equal to IFN-γ gene width. The sequence’s result show 91% similarity between gene canine IFN-γ from cloning and gene canine IFN-γ from Gene bank.

Kata Kunci : tuberkulosis, anjing, subkloning, IFN-γ, sekuensing