Efek Paclitaxel pada Lini Sel Kanker Payudara 4T1 dengan Knockout GSTM1 Menggunakan Single Maupun Double CRISPR gRNA: Kajian pada Ekson Berbeda

ZULFA HIDAYATI, dr. Dwi Aris Agung Nugrahaningsih, M.Sc.,Ph.D ; dr. Ahmad Hamim Sadewa, Ph.D

2022 | Tesis | MAGISTER ILMU BIOMEDIK

Latar belakang: Kasus Triple Negative Breast Cancer (TNBC) seringkali ditemukan dalam keadaan prognosis buruk karena sifatnya yang agresif dan memiliki karakteristik tidak mengekspresikan HER2, PR, dan ER. Tingkat kejadian TNBC mencapai 10-20%. Lini sel 4T1 adalah model lini sel kanker payudara TNBC yang diisolasi dari Mus musculus. Glutathione S-Transferase Mu-1 (GSTM1) merupakan salah satu gen yang mengalami overekspresi pada kasus TNBC. Kemoterapi paclitaxel masih menjadi opsi utama untuk kasus TNBC walaupun seringkali ditemukan masalah terkait sensitivitas dan resistensi. Knockout GSTM1 menginduksi penurunan glutathione (GSH) yang menyebabkan penurunan fungsi detoksifikasi dan pertahanan seluler. Efek dari penurunan GSH dapat meningkatkan sitotoksisitas paclitaxel sebagai bentuk respon kemoterapi lini sel 4T1. Tujuan: Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek paclitaxel pada lini sel kanker payudara 4T1 dengan knockout GSTM1 menggunakan single maupun double gRNA. Metode: Metode PCR digunakan untuk melihat secara visual ada tidaknya pita DNA GSTM1 pasca knockout dilanjutkan sekuensing dan analisis ICE untuk membuktikan insersi delesi GSTM1 dan qRT-PCR untuk memeriksa ekspresi mRNA GSTM1. MTT Assay digunakan untuk uji viabilitas dan menentukan IC50 paclitaxel pada sel 4T1. Hasil: Hasil pemeriksaan PCR menunjukkan pita DNA masih terdeteksi baik pada sel yang di KO menggunakan single gRNA maupun double gRNA dibuktikan dengan hasil panjang base pair DNA GSTM1. Hasil kuantifikasi sekuensing menunjukkan sel yang di KO menggunakan single gRNA menghasilkan persen indel dan score knockout lebih rendah dibandingkan sel yang di KO menggunakan double gRNA. Hasil ekspresi mRNA menunjukkan sel yang di KO menggunakan double gRNA secara signifikan menurunkan ekspresi mRNA GSTM1 di daerah ekson 2 namun tidak pada ekson 4 dibandingkan sel yang di KO menggunakan single gRNA. Efek knockout menggunakan single maupun double gRNA tidak memengaruhi perbedaan nilai IC50 paclitaxel (P>0,05). Kesimpulan: Hasil penelitian ini menyimpulkan bahwa knockout menggunakan single dan double gRNA tidak menyebabkan delesi pita DNA GSTM1. Penggunaan double gRNA dapat meningkatkan efisiensi CRISPR dalam menginduksi indel pada GSTM1. Penggunaan double gRNA signifikan menurunkan eskpresi mRNA GSTM1 di daerah ekson 2. Efek penggunaan single dan double gRNA tidak menghasilkan perbedaan signifikan terhadap nilai IC50 paclitaxel.

Background: Cases of Triple Breast Cancer are found oftenly in poor prognostic because aggressive and characterized by absence HER2, PR, and ER. Incidence rate of TNBC 10-20%. 4T1 cell line is a breast cancer model cell line isolated from Mus musculus. Glutathione S-Transferase Mu-1 is one of gene that over expressed in TNBC. Paclitaxel chemoteraphy still becomes primary option for TNBC, although sensitivity and resistance problems oftenly found. GSTM1 knockout induces deficiency of glutathione (GSH) which leads to decreased detoxification and cellular defence. The deficiency glutathione may increase the cytotoxicity of paclitaxel as a response chemoteraphy for 4T1 cell line. Objective: This study aim to determine the effect of paclitaxel in 4T1 cell line with GSTM1 knockout using single or double gRNA. Methods: The PCR method was used to visually see the presence or absence of GSTM1 band DNA, followed by Sanger sequencing and ICE software to check insertion deletion in GSTM1 and qRT-PCR to check in mRNA level. MTT Assay was used to test cell viability and to fix the IC50 paclitaxel. Results: The PCR results showed that DNA bands were still detectable in 4T1 cells which knocked out using single or double gRNA. The quantification of sequencing showed that the cells were treated using single gRNA resulted indel percentage and knockout score relatively lower than cells were treated using double gRNA. The cells were treated using double gRNA significantly decrease mRNA expression in exon 2, but not in exon 4 than the cells were treated using single gRNA. The IC50 paclitaxel showed not significantly difference (p>0,05) both in cells were treated using single or double gRNA. Conclussions: The conclusion of this study, knockout using single and double gRNA did not affect in deletion of GSTM1 bands. The usage of double gRNA may increase the efficiency of CRISPR to induce insertion deletion in GSTM1. The usage of double gRNA significantly decreased GSTM1 mRNA in exon 2. The usage of single or double gRNA did not affect the signification of paclitaxel IC50.

Kata Kunci : GSTM1, guide RNA, Knockout, Paclitaxel, Sel 4T1, GSTM1, guide RNA, Knockout, Paclitaxel, 4T1 cell line