Deteksi Stabilitas T-DNA 35S::GR::AtRKD4 pada Genom Tanaman Anggrek Dendrobium lineale Rolfe Transgenik untuk Induksi Embriogenesis Somatik

GDE CAHYADI W, Prof. Dr. Endang Semiarti, M.S.,M.Sc

2022 | Tesis | MAGISTER BIOLOGI

Dendrobium lineale Rofle merupakan salah satu anggrek endemik Papua yang terancam punah dikarenakan overeksploitasi dan degradasi habitatnya akibat aktivitas pembukaan lahan. Status konservasi D. lineale berada pada status Appendix II yang berarti populasinya secara alami akan terus menurun jika tetap dieksploitasi. Oleh karena itu tindakan konservasi secara in situ maupun ex situ perlu dilakukan sebagai upaya menjaga eksistensi D. lineale. Propagasi secara massal D. lineale dengan kultur in vitro merupakan cara yang efektif untuk menjaga kelestariannya di alam. Sejauh ini salah satu metode kultur in vitro yang menjanjikan hasil yang optimal adalah melalui embriogenesis somatik. Embriogenesis somatik dapat lebih optimal apabila dikombinasikan dengan insersi gen embrio AtRKD4 pada genom protokorm tanaman anggrek D. lineale dengan menggunakan metode Agrobacterium-mediated transformation yang membawa plasmid pTA7002 yang membawa T-DNA pembawa 35S::GR::AtRKD4 . Tujuan penelitian ini adalah : 1) mendeteksi integrasi T-DNA pembawa 35S::GR::AtRKD4 pada genom anggrek D. lineale transgenik, 2) mengetahui pengaruh pemberian TDZ terhadap induksi embrio somatik pada anggrek D. lineale transgenik, 3) mendapatkan organ terbaik seagai eksplan untuk induksi embrio somatik tanaman anggrek D.lineale transgenik pembawa T-DNA 35S::GR::AtRKD4. Metode penelitian meliputi konfirmasi integrasi transgen AtRKD4 pada genom tanaman transgenik dengan metode PCR, analisis sekuen DNA hasil PCR untuk mendapatkan urutan nukleotida dari transgen AtRKD4, kemudian induksi pembentukkan embrio somatik pada eksplan daun dan akar anggrek D. lineale dengan penambahan TDZ (0, 1, 2, 3 mg. L-1) dan DEX (0, 10, 15, 20 mikromolar) pada medium NP cair selama 5 hari kemudian dipindahkan ke medium NP0 untuk diamati perkembangannya. Hasil penelitian menunjukkan bahwa transgen AtRKD4 tetap terintegrasi secara stabil pada genom tanaman D. lineale transgenik yang berumur 2 tahun 8 bulan yang didukung dengan hasil analisis sekuen urutan basa transgen AtRKD4 yang menunjukkan similaritas dengan data urutan sekuen nukleotida gen RKD4 pada A. thaliana. Embrio somatik yang optimal ditunjukkan pada eksplan akar yang diinduksi dengan 2 mg. L-1 TDZ dengan kombinasi 10 mikromolar DEX dengan rerata jumlah embrio yang terbentuk adalah 1,39 plusminus 0,89. Kesimpulan dari penelitian ini adalah T-DNA tetap terintengrasi secara stabil pada genom tanaman D.lineale dan mampu menginduksi proses embriogenesis somatik pada akar dengan penambahan kombinasi 2 mg. L-1 TDZ dan 10 mikromolar DEX pada medium.

Dendrobium lineale Rolfe is one of endemic orchids from Papua which is threatened to be extinct due to overexploitation and degradation of its habitat due to land clearing activities. The conservation status of D. lineale is in Appendix II status, which means its population will continue to decline if it is still exploited. Therefore, in situ and ex situ conservation need to be conducted to maintain the existence of D. lineale. Mass propagation of D. lineale by in vitro culture is an effective way to maintain its sustainability in nature. So far, one of the in vitro culture methods that promises optimal results is through somatic embryogenesis. Somatic embryogenesis can be optimized when combined with the insertion of the AtRKD4 embryo gene into the genome of D. lineale orchid's protocorms using Agrobacterium-mediated transformation method carrying the plasmid pTA7002 carrying the T-DNA carrying 35S::GR::AtRKD4 . The aims of this study were: 1) to detect the integration of T-DNA carrying 35S::GR::AtRKD4 in the genome of D. lineale orchids transgenic, 2) determine the effect of TDZ on somatic embryo induction in D. lineale transgenic, and 3) to obtain the best explant which use to induction of somatic embryogenesis from transgenic D. lineale orchid carrying T-DNA 35S::GR::AtRKD4. The methods are confirmation of the stable integration of the AtRKD4 in the transgenic genome using PCR method, Analyses of DNA sequences from PCR results using AtRKD4 primers, induction of somatic embryogenesis in leaf and root explants of D. lineale orchid with the addition of TDZ (0, 1, 2, 3 mg. L-1) and DEX (0, 10, 15, 20 Micromolar) in liquid NP medium for 5 days, then transferred to NP0 medium and observed the development within 14 weeks. The results showed that the T-DNA carrying AtRKD4 gene were stably integrated in the genome of 2 years and 8 months-old D. lineale transgenic plants, that supported by the results of the PCR and sequence data which show similarity with the sequence of RKD4 gene. Induction of somatic embryogenesis as optimally shown in root explants, that induced by a combination between 2 mg. L-1 TDZ and 10 micromolar DEX that induced an average number of embryos of 1,39 plusminus 0,89. In conclusion, T-DNA remained stably integrated in the D. lineale plant genome and was able to induce somatic embryogenesis in roots with the addition of a combination of 2 mg L-1 TDZ and 10 micromolar DEX on medium.

Kata Kunci : Dendrobium lineale, AtRKD4, TDZ, embriogenesis somatik