APLIKASI METODE AGROINFILTRASI TRANSFORMASI GENETIK PADA TANAMAN ANGGREK DENGAN MENGGUNAKAN CRISPR/Cas9 GENOME EDITING SYSTEM

ADITYA NUR SUBCHAN, CRISPR/Cas9, Agroinfiltrasi, Dendrobium macrophyllum, Transformasi

2022 | Tesis | MAGISTER BIOLOGI

Anggrek (Orchidaceae) adalah tanaman ornamental yang umumnya memiliki bunga yang indah. Salah satu jenis anggrek yang paling banyak diminati dan dibudidayakan sebagai anggrek lokal adalah Dendrobium macrophyllum. Namun fase pertumbuhan anggrek tergolong lama, sehingga diperlukan metode inovatif untuk meningkatkan karakter dari anggrek salah satunya dengan penambahan karakter varigata. Usaha untuk meningkatkan karakter fenotip dapat dilakukan dengan metode penyuntingan genom (genome editing) menggunakan CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Protein Cas 9) melalui teknik agroinfiltrasi dengan menyuntikkan gen asing pada jaringan tanaman. CRISPR/Cas9 merupakan metode genome editing terkini yang dapat menyebabkan terjadinya mutasi, knock in maupun knock out gen target. CRISPR/Cas9 telah digunakan pada anggrek, namun masih sangat minim serta efisiensi transformasi genetik masih di bawah 2% (rendah). Penelitian ini bertujuan mengembangkan dan meningkatkan persentase efisiensi transformasi melalui agroinfiltrasi pada anggrek D. macrophyllum yang dimediasi dengan Agrobacterium melalui sistem CRISPR/Cas9. Metode yang digunakan terdiri dari 1) Transformasi pRGEB32 yang mengandung T-DNA ke A. tumefaciens EHA105; 2) Konfirmasi keberadaan T-DNA pada pRGEB32/A.tumefaciens EHA105 dengan PCR menggunakan primer Cas9 dan HPT; 3) Transfer T-DNA ke genom tanaman menggunakan agroinfiltrasi Agrobacterium; 4) Konfirmasi integrasi T-DNA pada genom transforman. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa 8 tanaman D. macrophyllum transforman yang diuji dengan PCR terbukti membawa T-DNA pada genomnya dengan hasil amplifikasi DNA positif untuk gen Cas9 (402 bp), HPT (545 bp), VAR2 (723 bp), dan ACTIN (114 bp) sebagai kontrol internal. Sebanyak 60 sampel agroinfiltrasi (100%) positif membawa T-DNA. Metode Agroinfiltrasi dapat menjadi metode alternatif yang inovatif untuk genome editing system dengan CRISPR/Cas9 pada anggrek.

Orchids (Orchidaceae) are ornamental plants that generally have beautiful flowers. One of the most popular types of orchids and cultivated as a local orchid is Dendrobium macrophyllum. However, the orchid growth phase is relatively long, so innovative methods are needed to improve the character of the orchid, one of which is the addition of varigata characters. Efforts to improve the phenotypic character can be done by using the genome editing method using CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Protein Cas 9) through agroinfiltration techniques by injecting foreign genes into plant tissues. CRISPR/Cas9 is the latest genome editing method that can cause mutation, knock in and knock out of target genes. CRISPR/Cas9 has been used on orchids, but it is still very minimal and the efficiency of genetic transformation is still below 2% (low). This study aims to develop and increase the percentage of transformation efficiency through agroinfiltration of D. macrophyllum orchids mediated by Agrobacterium through the CRISPR/Cas9 system. The method used consisted of 1) Transformation of pRGEB32 containing T-DNA into A. tumefaciens EHA105; 2) Confirmation of the presence of T-DNA in pRGEB32/A.tumefaciens EHA105 by PCR using Cas9 and HPT primers; 3) Transfer of T-DNA to plant genome using Agrobacterium agroinfiltration; 4) Confirmation of T-DNA integration in the transformant genome. The results of this study showed that 8 D. macrophyllum transformants tested by PCR were proven to carry T-DNA in their genomes with positive DNA amplification results for the genes Cas9 (402 bp), HPT (545 bp), VAR2 (723 bp), and ACTIN ( 114 bp) as internal control. A total of 60 agroinfiltration samples (100%) were positive for carrying T-DNA. Agroinfiltration method can be an innovative alternative method for genome editing system with CRISPR/Cas9 in orchids.

Kata Kunci : CRISPR/Cas9, Agroinfiltrasi, Dendrobium macrophyllum, Transformasi